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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 1211 (2023) Citar este artículo

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Una característica clave que distingue la bioimpresión 3D de otras técnicas de cultivo celular 3D es su control preciso sobre las estructuras creadas. Esta propiedad permite la fabricación de alta resolución de estructuras biomiméticas con propiedades estructurales y mecánicas controladas, como porosidad, permeabilidad y rigidez. Sin embargo, el análisis de la dinámica celular posterior a la impresión y la optimización de sus funciones dentro del entorno fabricado en 3D solo es posible mediante prueba y error y replicando varios experimentos. Este problema motivó el desarrollo de un modelo de autómatas celulares por primera vez para simular el comportamiento celular posterior a la impresión dentro de la construcción bioimpresa en 3D. Para mejorar nuestro modelo, bioimprimimos una construcción 3D utilizando hidrogel cargado de células MDA-MB-231 y evaluamos las funciones celulares, incluida la viabilidad y la proliferación en 11 días. Los resultados mostraron que nuestro modelo simuló con éxito la estructura bioimpresa en 3D y capturó observaciones in vitro. Demostramos que el modelo in-silico podría predecir y dilucidar las funciones biológicas posteriores a la impresión para diferentes números de células iniciales en bioink y diferentes formulaciones de bioink con gelatina y alginato, sin replicar varias mediciones in vitro costosas y que consumen mucho tiempo. Creemos que dicho marco computacional tendrá un impacto sustancial en la aplicación futura de la bioimpresión 3D. Esperamos que este estudio inspire a los investigadores a darse cuenta de cómo se podría utilizar un modelo in-silico para avanzar en la investigación de bioimpresión 3D in vitro.

Uno de los métodos florecientes de biofabricación en 3D es la bioimpresión tridimensional (3D), que se aplica ampliamente en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos para fabricar estructuras complejas miméticas de tejidos1. La aplicación de esta técnica tiene un gran potencial en la terapia personalizada con más énfasis en el control de la liberación de fármacos, la detección de fármacos para el tratamiento del cáncer, el estudio de posibles efectos secundarios y el análisis de metástasis e invasión de células tumorales2. La técnica de bioimpresión 3D combina células, biomateriales y sistemas motores controlados para desarrollar estructuras 3D complejas y tiene un control preciso sobre las características de la estructura, como las propiedades mecánicas, la porosidad, la permeabilidad y la rigidez3,4,5. Esta técnica puede superar múltiples limitaciones de los métodos 3D tradicionales al incorporar aspectos importantes del hábitat celular. Estos aspectos incluyen un microambiente 3D no uniforme similar a la matriz extracelular natural (MEC) de los tumores, interacciones complejas de las células con sus células vecinas y con la MEC local, y complicados procesos de difusión de nutrientes y oxígeno6,7,8. Por lo tanto, este método se puede utilizar para representar mejor los conocimientos sobre los mecanismos de crecimiento celular y proporcionar una predicción más precisa de la dinámica tumoral in vivo y la respuesta de las células cancerosas a las terapias7.

A pesar del rápido avance del método de bioimpresión 3D, existen algunos desafíos que deben abordarse. Actualmente, la técnica de bioimpresión se basa principalmente en el ensayo y error para lograr el resultado deseado, lo que aumenta la necesidad de técnicas experimentales. Esta base de prueba y error incluye la optimización de las propiedades de la biotinta y su imprimibilidad, la resistencia mecánica de la estructura y la viabilidad celular durante y después de la impresión. Por lo tanto, es muy costoso optimizar los experimentos relacionados con la bioimpresión9. Estos desafíos hacen que el diseño experimental y la recopilación de datos sean más complicados en este proceso.

Los métodos in silico se pueden utilizar para complementar los experimentos in vitro y ayudar a abordar algunas de las limitaciones de este método 3D10,11,12. Los enfoques in-silco comunes incluyen métodos de aprendizaje automático (ML) y modelado mecánico. Los modelos ML se pueden categorizar aún más como redes neuronales profundas, bosques aleatorios, máquinas de vectores de soporte (SVM) y clasificadores de árboles. ML es cada vez más conocido por su aplicación en diferentes etapas del proceso de impresión 3D, como la optimización de procesos, el análisis de precisión de construcción, el diagnóstico de defectos y la predicción de propiedades de biotintas13. Por ejemplo, Xu et al.14 crearon con éxito un modelo predictivo utilizando enfoques ML para anticipar la viabilidad celular con buena sensibilidad y para evaluar la importancia de varios parámetros del proceso, incluida la intensidad UV y el tiempo de exposición UV, sobre la viabilidad celular en la bioimpresión 3D basada en estereolitografía. . Múltiples estudios también han intentado desarrollar diferentes técnicas basadas en ML para optimizar la capacidad de impresión de las biotintas. Por ejemplo, Lee j et al.15 demostraron la relación entre la capacidad de impresión y las características mecánicas de la tinta utilizando un análisis de regresión múltiple. Sin embargo, a pesar del gran avance en la aplicación de modelos ML en las ciencias biomédicas, este método enfrenta algunas limitaciones según el proceso de recolección de datos y el objetivo del estudio.

Para hacer predicciones precisas, los modelos de ML requieren grandes volúmenes de datos, seleccionar un algoritmo adecuado y determinar las entradas y salidas de interés16. Puede ser poco práctico adquirir grandes cantidades de datos de la investigación de bioimpresión que involucran células y materiales costosos y procesos que consumen mucho tiempo. Otro desafío común para las aplicaciones de ML es que pueden ser difíciles de interpretar. Esto puede generar una falta de confianza por parte de los investigadores que buscan una interpretación mecanicista del comportamiento celular en estructuras bioimpresas17. Por el contrario, el modelado mecanicista se refiere a la descripción de fenómenos a través de hipótesis de mecanismos subyacentes. Los modelos mecanísticos incluyen modelos estocásticos y basados en agentes, modelos discretos, ecuaciones diferenciales ordinarias (EDO) y ecuaciones diferenciales parciales (EDP). Dichos modelos mecánicos pueden proporcionar información sobre los aspectos mecánicos de los comportamientos celulares en estructuras bioimpresas. y son, por lo tanto, nuestra técnica matemática preferida en este estudio.

Cada vez hay más investigaciones sobre el modelado y la simulación mecanicistas como parte del proceso de bioimpresión 3D. Por ejemplo, existen múltiples estudios matemáticos que predicen el esfuerzo cortante aplicado sobre el biotinta y las células en la boquilla18,19; predecir las propiedades mecánicas de la estructura impresa final en base a las propiedades del material de biotinta20; y simular la deposición de biotinta y la forma definitiva de la estructura 3D creada9. Estas técnicas matemáticas han intentado simular el proceso de bioimpresión, durante y después de la bioimpresión, para investigar el efecto de diferentes parámetros en varios aspectos de la bioimpresión, incluida la viabilidad celular y la estabilidad estructural.

Sin embargo, aún no se ha informado sobre un estudio computacional completo del comportamiento posterior a la impresión de las células incrustadas en estructuras bioimpresas en 3D. Dichos estudios matemáticos pueden proporcionar a los investigadores más información sobre el funcionamiento de las células posteriores a la impresión y permitirles predecir actividades celulares complejas y optimizar el microambiente celular para ahorrar dinero y tiempo al mantener las evaluaciones experimentales al mínimo. Este es el primer estudio que tiene como objetivo desarrollar una integración de modelos de cáncer de mama bioimpresos en 3D in vitro e in-silico para estudiar el comportamiento posterior a la impresión de una población de células de cáncer de mama incrustadas en una estructura bioimpresa en 3D (Fig. 1). En el estudio in vitro, utilizamos la línea celular MDA-MB-231, una de las líneas celulares de cáncer de mama más agresivas que se usa con más frecuencia en estudios relacionados con el cáncer. Para desarrollar la biotinta, se selecciona una mezcla de gelatina y alginato como el material de biotinta más común en la bioimpresión 3D debido a su característica similar a la ECM nativa y a las propiedades fisiológicas y biológicas apropiadas para la aplicación de bioimpresión21. Para nuestro estudio in-silico, seleccionamos el modelado de autómatas celulares, en el que la mayoría de los parámetros se seleccionaron a partir de datos experimentales. También se realizaron ensayos completos in vitro para mejorar la confiabilidad del modelo.

Ilustración esquemática de los principales pasos involucrados en este estudio; paso 1: preparación de biotinta que consta de gelatina, alginato y línea celular MDA-MB-231; paso 2: impresión y reticulación de la estructura 3D cargada de células; paso 3: realización de ensayos in vitro posteriores a la impresión; Paso 4: desarrollar y calibrar un modelo in-silico. Creado con BioRender.com.

El modelo basado en agentes propuesto en este estudio es beneficioso para demostrar sistemas celulares complejos, incluida la proliferación celular, el movimiento, las interacciones celulares con el medio ambiente (p. ej., ECM, células vecinas y consumo de recursos) y la agregación celular dentro del andamio. En este estudio, demostramos que los modelos matemáticos y las simulaciones in-silico se pueden utilizar para capturar la dinámica in vitro. Esta combinación de estudios in vitro e in silico puede mejorar la comprensión de los investigadores de las actividades celulares dentro de construcciones bioimpresas en 3D con el fin de acelerar y aumentar la precisión de la optimización y los entornos experimentales. El modelo in-silico propuesto es muy prometedor y se puede desarrollar más para aplicarlo en el cultivo de células 3D utilizando técnicas de bioimpresión en diferentes aplicaciones biomédicas.

El modelo de red de hidrogel similar a un tumor se imprimió con éxito (Fig. 2a). Para determinar la proliferación de células MDA-MB-231 incrustadas en el hidrogel, se utilizó el ensayo MTT para monitorear la actividad metabólica celular en los días 0, 4, 7, 10 y 11. Como se ilustra en la Fig. 2b, en comparación con el día 0, Las células MDA-MB-231 en la construcción de células/hidrogel 3D demostraron una proliferación de 1,86, 2,7 y 2,78 y 2,8 veces en los días 4, 7, 10 y 11, respectivamente. De hecho, las células mostraron una rápida proliferación en los primeros 7 días y casi mantuvieron una proliferación celular estancada del día 7 al 11. Curiosamente, los resultados mostraron que el tiempo de duplicación del MDA-MB-231 encapsulado en el microambiente 3D fue tres veces mayor que la de las células cultivadas en cultivos 2D, lo que puede atribuirse a la reducción de las actividades celulares dentro de la matriz 3D22. Desde el día 7 hasta el día 11, el número de células proliferantes se mantuvo aproximadamente constante y dejó un interrogante: si las células morían o entraban en la fase de no proliferación (quiescente) debido a condiciones no deseadas. Para responder a esta pregunta, se empleó el ensayo vivo-muerto, así como la inmunotinción Ki-67, durante un período de 11 días para obtener una mejor comprensión del crecimiento del comportamiento celular encapsulado en el andamio 3D.

(A): estructura de hidrogel/célula fabricada utilizando la técnica de bioimpresión 3D; (B): Proliferación de MDA-MB-231 incrustada en la impresión posterior de la red de hidrogel desde el día 0 hasta el día 11. Las barras de error representan ± SD, n ≥ 3.

La viabilidad de MDA-MB-231 durante 11 días se visualizó mediante la tinción de vivos y muertos, que coincidía con los resultados del ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 2, la mayoría de las células eran viables después de la impresión, y la tasa de viabilidad de las células fue del 76 ± 2 % en el día 0, lo que demostró claramente un daño menor del proceso de bioimpresión en la viabilidad celular. La tasa de viabilidad aumentó durante la primera semana y alcanzó el 98 ± 1 % y el 99 ± 1 % el día 4 y el día 7, respectivamente. Por lo tanto, la estructura era lo suficientemente porosa para que el oxígeno y la glucosa se difundieran y distribuyeran a través del andamio de hidrogel, lo que podría proporcionar un entorno de vida adecuado para las células. Del día 7 al día 11, aunque algunas células murieron, la mayoría de las células sobrevivieron y la tasa de viabilidad alcanzó el 96 ± 2 % en el día 11. Al comparar los resultados del ensayo vivo-muerto y el ensayo MTT, se puede concluir que una parte importante de las células entró en fase de reposo después de siete días desde que se alcanzó la capacidad máxima del andamio, y algunas de las células comenzaron a morir durante la fase estacionaria a largo plazo, o por falta de recursos. La muerte celular en este experimento es casi insignificante, lo que ilustra el prometedor potencial del andamio de gelatina/alginato para aplicaciones de bioimpresión durante mucho tiempo.

Para visualizar la capacidad proliferativa de MDA-MB-231, las células se fijaron y se usó un anticuerpo anti-Ki-67 para obtener imágenes de las células en proliferación usando un microscopio confocal (Figs. 3, 4). Ki-67 es un marcador de uso común que está presente en todas las fases activas del ciclo celular pero está ausente en las células en la fase estacionaria23. Los resultados demostraron que en los días 0 y 4, casi el 98 ± 1 % y el 95 ± 2 % de las células fueron positivas para ki-67, respectivamente, mientras que este número disminuyó a 86 ± 2 % el día 7, seguido de una caída drástica a aproximadamente 48,2 ± 2,4 en el día 11. Este resultado está de acuerdo con los datos anteriores (Fig. 3), lo que ilustra que dentro de los siete días, las células no solo sobreviven sino que también mantienen su capacidad de proliferación. Desde el día 7 hasta el día 11, aunque se demostró que una alta proporción de células estaban vivas, estaban inactivas y ya no podían proliferar debido a la falta de espacio suficiente para que proliferaran las células. Además, en los días 7 y 11, las células se agregaron más, particularmente cerca de los poros, y se demostró que las células en el centro de los agregados celulares no proliferaban debido a que estaban rodeadas por otras células. Por lo tanto, el proceso de proliferación fue abortado debido a que no había suficiente espacio para colocar las células hijas y debido a la falta de nutrientes y oxígeno en el centro de los agregados.

Imágenes microscópicas que demuestran la viabilidad de las células MDA-MB-231 dentro de construcciones de hidrogel 3D usando el kit de ensayo fluorescente vivo/muerto desde el día 0 hasta el día 11. Las células vivas y muertas se tiñeron usando calceína-AM y PI, respectivamente (el color verde representa las células vivas ; el color rojo representa las células muertas). Se tomaron imágenes de las células utilizando el microscopio confocal de barrido láser. Barra de escala, 50 μm (imágenes ampliadas, barra de escala, 30 μm).

Tinción con Ki-67 de células MDA-MB-231 encapsuladas dentro de construcciones bioimpresas en 3D. Las células se tiñeron usando anticuerpos anti-Ki-67 visualizados con Alexa Fluor 546 y Hoechst 33,342 (el color rojo representa las células positivas para ki-67; el color azul representa todas las células). Se tomaron imágenes de las células utilizando el microscopio confocal de barrido láser. Barra de escala, 50 μm (imagen ampliada, barra de escala, 30 μm).

Los resultados de los experimentos in vitro se aplicaron para parametrizar el modelo matemático desarrollado.

Una propiedad esencial que hace que la técnica de bioimpresión 3D sea superior a otras técnicas de cultivo celular 3D es el control preciso que ofrece sobre las estructuras creadas. Esta propiedad brinda la oportunidad de fabricar estructuras biomiméticas con propiedades estructurales y mecánicas controladas, como porosidad, permeabilidad y rigidez con alta resolución24,25,26. Sin embargo, analizar el comportamiento de las células después de la impresión dentro del andamio depende únicamente de realizar diferentes mediciones in vitro. La medición experimental de algunos aspectos del comportamiento celular en estructuras bioimpresas en 3D es un desafío debido a la falta de técnicas cuantitativas precisas, como la definición de interacciones célula-célula y célula-microambiente. Este problema ha motivado nuestro desarrollo de un marco matemático para simular el comportamiento celular posterior a la impresión dentro del andamio. Este marco no solo debe superar estos desafíos, sino que también debe diseñar y predecir con precisión las funciones celulares posteriores a la impresión sin replicar los experimentos.

El modelado basado en individuos utilizando un autómata celular es un método para simular el mecanismo espacial y temporal del crecimiento celular a nivel celular27,28. Este enfoque es un sistema dinámico que incluye cuadrículas de celdas, y cada celda tiene conjuntos de estados discretos29. El modelado CA se ha utilizado ampliamente en los últimos años para investigar diferentes mecanismos de células cancerosas basados en una variedad de reglas de autómatas estáticos30. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha aplicado el modelado de CA en el cultivo de células cancerosas en 3D mediante bioimpresión 3D. Seleccionamos este método matemático para este estudio sobre la simulación del crecimiento celular encapsulado en una estructura bioimpresa en 3D debido a su capacidad para capturar las propiedades espaciales de la estructura de impresión 3D y su flexibilidad para explorar diferentes hipótesis. Además, dado que los datos obtenidos de nuestros experimentos in vitro contenían células en forma discreta, esta técnica matemática discreta tendría una simulación más precisa de este proceso. El marco desarrollado en este estudio representa reglas en la proliferación celular, viabilidad, movimiento e interacciones con el medio ambiente, que incluye hidrogel y células vecinas, así como formaciones de grupos dentro de la red de hidrogel. Los resultados in-silico demostrados en este artículo se basan en valores medios y desviaciones estándar de n = 100 ejecuciones de simulación, donde n está motivado por el análisis de consistencia (material complementario, análisis de consistencia).

La figura 5, que muestra los patrones de proliferación celular durante 11 días dentro del andamio tanto in vitro como in silico, los ilustra de acuerdo entre sí. En la proliferación celular, la densidad celular inicial y la capacidad del andamio son dos parámetros clave que especificamos como \({C}_{\mathrm{initial}}\) y \(C\) variables, respectivamente. Los valores correspondientes de estos parámetros se determinaron mediante calibración para producir el mejor ajuste a los estudios in vitro. Tenga en cuenta que la densidad celular inicial en el modelo desarrollado representa la población inicial efectiva de células que pueden interactuar entre sí dentro de una capa delgada, no el número total de células en el andamio. Por lo tanto, la densidad celular simulada se redujo por un factor de escala en comparación con la densidad celular en los entornos experimentales. Los resultados mostraron que las células alcanzaron la densidad celular máxima de células tanto en la simulación como en los experimentos después de siete días. El tiempo que tardaron las células en alcanzar la máxima densidad en el andamio dependía en gran medida del número de células iniciales y de la capacidad del andamio impreso. Cuanto mayor era el número de células iniciales y menor la capacidad del andamio, antes las células alcanzaban la densidad celular máxima y detenían la proliferación. Por lo tanto, al ajustar estos parámetros y ejecutar simulaciones en diferentes escenarios, los investigadores pueden diseñar los experimentos para lograr los resultados deseados sin repetir los ensayos in vitro.

Comparación entre los resultados in vitro e in silico de la proliferación de células MDA-MB-231 dentro de la red de hidrogel 3D. Las barras de error representan ± SD, n ≥ 3.

Los datos simulados también pudieron replicar consistentemente los resultados experimentales de viabilidad y proliferación. Como se explicó en la sección anterior, aunque las células mostraron una viabilidad de alrededor del 99 % dentro de los siete días posteriores a la impresión, la cantidad de células muertas aumentó ligeramente desde el día 7 hasta el día 11, cuando la parte significativa de las células estaba en la fase de reposo. Por lo tanto, para simular con precisión la condición in vitro, se supuso que las células que permanecían en una fase estacionaria prolongada durante más de las horas especificadas, definidas por un número estocástico (\({C}_{d}\)), comenzaban morir con una probabilidad especificada (\({P}_{d}\)). Esta observación puede explicarse biológicamente por la incapacidad de las células para volver a entrar en el ciclo celular después de entrar en la fase estacionaria celular.

La Figura 5 muestra las instantáneas de células MDA-MB-231 in-silico que crecen dentro de la red de hidrogel; así como imágenes microscópicas in vitro de células en la estructura 3D. En esta figura, puede ver la distribución de las células y la progresión de la formación de grupos de células en los días 0, 4, 7 y 11 tanto in vitro como in silico. En las imágenes in-silico, las células de color amarillo, rojo y negro son representativas de las células proliferantes, no proliferantes y muertas, respectivamente.

El día 0, se distribuyeron algunas células dentro de la red de hidrogel. Con el tiempo, las células proliferaron y crearon los primeros grupos de dos células y luego otros más grandes. Al igual que en las observaciones in vitro, el porcentaje de viabilidad se mantuvo en torno al 100 % hasta el día 11, cuando la viabilidad disminuyó ligeramente y alcanzó el 93,74 ± 0,5 %. Además, la proliferación celular simulada disminuyó con el tiempo y después de siete días experimentó una caída significativa debido a que se alcanzó la capacidad máxima del andamio; y finalmente se redujo a 54,14 ± 0,25 % el día 11. La animación del crecimiento celular dentro del andamio de hidrogel en 11 días también está disponible en el Material complementario (Figura S3).

Otro factor importante además de la viabilidad y proliferación celular es la capacidad de las células para moverse en la matriz que las rodea. Esta simulación también se puede aplicar para analizar el movimiento celular, así como la estructura y distribución de los grupos de tumores formados en la red de hidrogel sin evaluación experimental. Los grupos de tumores pueden crearse debido a interacciones entre células vecinas o entre células progenitoras e hijas, según su posición y el microambiente31. De hecho, las células se coordinan a través de interacciones físicas y de señalización célula-célula y crean grupos.

En la Figura S1 (Material complementario), las células muestran una tendencia a arrastrarse hacia los poros del andamio seguido de la formación de grupos alrededor de esos poros, ya que los recursos esenciales se encuentran en mayor concentración allí, particularmente después de siete días. Este hecho sugiere que las redes de hidrogel tenían una capacidad de transporte de recursos limitada. Por lo tanto, hemos definido rangos particulares de atracción tanto para la señalización célula-célula (\({L}_{C}\)) como para la atracción célula-poro (\({L}_{p}\)) para considerar diferentes células. direcciones de migración. La velocidad de movimiento fue otro parámetro importante que afectó la formación de grupos. Falica et al. ilustró que el movimiento de las células cancerosas se inhibe en microambientes 3D y muestra una velocidad extremadamente baja debido a la combinación de la rigidez del material y el anclaje de los receptores celulares22. Por lo tanto, en base a las observaciones en este y estudios anteriores, hemos calibrado la velocidad de movimiento de la celda. En los procesos de movimiento, cada individuo se movía en un tiempo específico definido como \({m}_{C}\) en una dirección determinada en base a la atracción celular. Durante el proceso de calibración, al comparar los resultados in vitro e in-silico, se concluyó que las células tenían menos tendencia a moverse hacia las células vecinas dentro de un rango de atracción más pequeño (\({L}_{C}\)) en comparación con la superficie/poros del andamio (\({L}_{p}\)). Al aplicar estas reglas en el modelo (Fig. 6), las células imitan el comportamiento celular in vitro en términos de movimiento y formación de grupos. Los resultados del modelo propuesto son consistentes con los de estudios previos22,32.

Los paneles centrales visualizan el crecimiento de MDA-MB-321 dentro de la construcción de hidrogel 3D in silico; el amarillo representa células en proliferación; el rojo representa células que no proliferan; el negro representa las células muertas. Los paneles derecho e izquierdo representan células MDA-MB-231 encapsuladas en construcciones de hidrogel 3D observadas con un microscopio de contraste de fase los días 0, 4, 7 y 11: barra de escala, 50 μm.

En general, este modelo se desarrolla para combinarlo con evaluaciones de bioimpresión 3D in vitro, lo que lleva a un análisis exhaustivo de todas las estructuras fabricadas en 3D. Una de las principales aplicaciones de esta simulación es predecir el comportamiento celular posterior a la impresión en un microambiente no practicado que mejora su capacidad para replicar los entornos biológicos deseados. Por ejemplo, este modelo brinda la oportunidad de evaluar el impacto de diferentes parámetros importantes, como varias densidades celulares iniciales, en el comportamiento celular en un período a largo plazo. Esto puede beneficiar a los investigadores para generar un microambiente más adecuado para el crecimiento celular sin necesidad de repetir los experimentos. Por ejemplo, pueden diseñar el andamio en términos de tamaño o forma estructural con el propósito de modificar la capacidad del andamio para mejorar la proliferación celular y disminuir la muerte celular.

Para validar aún más el modelo in-silico, realizamos los procedimientos de bioimpresión con diferentes variables experimentales en dos situaciones diferentes: caso 1: densidades celulares iniciales variables; caso 2: formulación de biotinta variable. En el caso 1, hicimos bioimpresión con un bioink con 4% (\(w/v\)) de gelatina, 4% (\(w/v\)) de alginato y 1,5 × 1 \({0}^{6} \) Células MDA-MB-231 \({\mathrm{mL}}^{-1}\). En el caso 2: realizamos experimentos de bioimpresión con un bioink con concentraciones finales de 4 % (\(w/v\)) de gelatina, 5 % (\(w/v\)) de alginato y 2 × 1 \({0} ^{6}\) Células MDA-MB-231 \({\mathrm{mL}}^{-1}\). Usando el modelo in-silico calibrado, nos gustaría predecir el patrón de proliferación de las células en estas dos nuevas condiciones.

La figura 7, que muestra los patrones de proliferación celular durante 10 días para el caso 1 tanto in vitro como in silico, los ilustra de acuerdo entre sí. En el modelo in-silico, todos los parámetros excepto \({C}_{\mathrm{initial}}\) (la densidad celular inicial) tienen los mismos valores que en el modelo calibrado. La densidad celular simulada se reduce por el mismo factor de escala en comparación con la densidad celular en la configuración experimental y se establece en \({C}_{\mathrm{inicial}}=2000\). Tanto las simulaciones como los experimentos demostraron que las células no alcanzaron la densidad celular máxima después de 7 días y siguieron creciendo. Por lo tanto, cuando se redujo el número de células iniciales, las células posteriores alcanzaron su capacidad de andamiaje y, en consecuencia, dejaron de proliferar.

Predicción de la proliferación celular utilizando el modelo in-silico para el caso 1: 1,5 × 1 \({0}^{6}\) células MDA-MB-231 \({mL}^{-1}\) en gelatina al 4 %/ biotinta de alginato al 4 %; los días 0, 3, 7 y 10. El estudio in vitro se realizó utilizando el ensayo MTT. Las barras de error representan ± SD, n ≥ 3.

La figura 8, que compara los patrones de proliferación celular in vitro e in silico para el caso 2, también muestra concordancia. En este caso, de forma experimental, alteramos la formulación de la biotinta. El aumento de la concentración de alginato puede aumentar la rigidez de una construcción a base de hidrogel, como se demostró anteriormente33. También se ha encontrado que la rigidez del microambiente también afectaría el movimiento celular y la formación de esferoides dentro del andamio34. Aunque los parámetros directamente relacionados con la rigidez aún no se han integrado en nuestro modelo, podemos regular el comportamiento celular e investigar los impactos de la formulación de biotintas y la rigidez en la proliferación y migración variando algunas reglas de movimiento celular. En el modelo calibrado para bioink que contiene 4 % (p/v) de gelatina y 4 % (p/v) de alginato, las células se mueven cada 15 h, indicado por \({m}_{c}\). Por lo tanto, con 4 % (p/v) de gelatina, 5 % (p/v) de biotinta a base de alginato, reducimos la velocidad de movimiento de las células encapsuladas en un microambiente más rígido y cambiamos \({m}_{c}\) a 20 h manteniendo otros parámetros sin cambios. Al comparar los resultados de un modelo in-silico con los datos in vitro, concluimos que para un 4 % (p/v) de gelatina y un 5 % (p/v) de biotinta a base de alginato, \({m}_{c}\ )=20 h coincide estrechamente con la tendencia de proliferación in vitro en 11 días.

Predicción de la proliferación celular utilizando el modelo in-silico para el caso 2: 2 × 1 \({0}^{6}\) células \({mL}^{-1}\) en 4 % de gelatina/5 % de biotinta de alginato. El estudio in vitro se realizó utilizando el ensayo MTT. Las barras de error representan ± SD, n ≥ 3.

Las observaciones in vitro revelaron que el día 11, la proliferación celular disminuyó ligeramente, lo que puede explicarse por el microambiente más rígido. De hecho, la rigidez podría reducir el movimiento y la proliferación celular; y obstaculizan el transporte de nutrientes, lo que resulta en la muerte celular con el tiempo. Para cambios más significativos en la formulación de bioink, es necesario incorporar la rigidez del microambiente o parámetros relacionados con bioink en el modelo para anticipar el comportamiento celular con precisión. Sin embargo, con 4% (\(w/v\)) de gelatina, 5% (\(w/v\)) de alginato y modificaciones menores a la formulación de la biotinta, nuestro modelo desarrollado se puede utilizar con éxito.

En conjunto, podríamos validar nuestro modelo creando variaciones en los datos in vitro y simulando con éxito la variada situación. Por lo tanto, podemos afirmar con confianza que este modelo puede ayudar a los investigadores a planificar experimentos con mayor precisión al predecir el resultado. De hecho, los investigadores que ejecutan simulaciones en diversas situaciones y ajustan los parámetros relacionados pueden diseñar experimentos para alcanzar los resultados deseados sin repetir los procedimientos in vitro.

El marco matemático desarrollado en este estudio se puede aplicar ampliamente en diferentes estudios relacionados con la bioimpresión para diversas aplicaciones, como la ingeniería de tejidos, la oncología y la industria farmacéutica, al ampliar sus reglas y mejorar su capacidad para proporcionar una predicción precisa de los sistemas biológicos. Nuestro modelo se puede ampliar mediante la incorporación de parámetros relacionados con la biotinta, como la rigidez y la integridad estructural, que regulan el comportamiento celular, incluida la proliferación y migración y la difusión de oxígeno/nutrientes a la red 3D35,36,37,38,39.

Además, el modelo propuesto se puede integrar con los algoritmos de aprendizaje automático y brindar a los investigadores la oportunidad de predecir el efecto temporal o estructural de la red de hidrogel en cualquier objetivo deseado en el sistema biológico. Además, podemos usar la simulación CA para entrenar previamente el algoritmo ML y luego se puede aplicar un enfoque de aprendizaje de transferencia para entrenar los datos experimentales.

Otra perspectiva de este modelo es su aplicación en un entorno heterogéneo con múltiples líneas celulares para estudiar la interacción célula-célula y las interacciones célula-ECM. Además, al ajustar las reglas, este modelo se puede integrar con técnicas de modelado farmacocinético para simular respuestas al tratamiento farmacológico en cultivos celulares 3D utilizando bioimpresión 3D para ayudar a estudiar el desarrollo y la metástasis de tumores, la detección de fármacos y otros aspectos de la investigación del cáncer.

Al final, creemos que este trabajo o su combinación con otras técnicas de modelado pueden influir significativamente en el desarrollo de la bioimpresión 3D en el futuro y evitar en gran medida la realización de experimentos costosos y lentos.

Hasta ahora, el comportamiento óptimo posterior a la impresión de las células que crecen dentro del hidrogel bioimprimido en 3D se ha logrado mediante la replicación de varios experimentos, que consumen mucho tiempo y son costosos. En un intento por superar este desafío, desarrollamos un modelo CA para simular la dinámica de las células posteriores a la impresión dentro de la construcción bioimpresa en 3D. Con este fin, primero imprimimos con éxito MDA-MB-231/gelatina/biotinta de alginato y evaluamos el comportamiento celular en 11 días utilizando ensayos de proliferación de células MTT, Live-dead y Ki-67. Con los resultados in vitro, definimos reglas en el modelo CA para la proliferación celular, la viabilidad, el movimiento y la formación de grupos dentro de la red de hidrogel 3D y calibramos los parámetros del modelo, como el tiempo de duplicación, la velocidad de movimiento y la probabilidad de muerte en 11 días. Nuestro modelo puede capturar cuantitativamente el comportamiento in vitro posterior a la impresión de las células en el andamio 3D y es capaz de predecir y dilucidar el comportamiento celular para diferentes condiciones de bioimpresión. Por ejemplo, replica el movimiento celular y el rastreo celular hacia los poros, seguido de la formación de grupos después de siete días debido a la distribución desigual de nutrientes y oxígeno. Además, los datos in-silico aclaran la dependencia de la proliferación celular en el número inicial de células y la capacidad de la red de hidrogel impresa, y pueden predecir la proliferación celular posterior a la impresión en función de la cantidad inicial de células en biotinta. Este modelo in-silico también puede representar la actividad celular utilizando varias formulaciones de red que contienen gelatina y alginato. El marco matemático propuesto puede beneficiar a los investigadores para generar un microambiente más adecuado para el crecimiento celular sin necesidad de repetir los experimentos. Por lo tanto, nuestro marco matemático puede considerarse un paso ingenioso involucrado en el avance de los estudios relacionados con la bioimpresión.

La sal de sodio del ácido algínico, el dimetilsulfóxido (DMSO), el cloruro de sodio, el cloruro de calcio (CaCl2) y la gelatina de piel bovina (tipo B) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Canadá). Para los estudios de cultivo celular, se adquirieron MDA-MB-231 de ATCC, DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco), FBS (suero fetal bovino), penicilina/estreptomicina, solución de tripsina/EDTA al 0,25 % (p/v) y fosfato Las tabletas de solución salina tampón (PBS) se compraron a Wisent Bioproducts. (Bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2H-tetrazolio) MTT en polvo, Triton X-100, BSA (albúmina sérica bovina) y paraformaldehído se adquirieron de Sigma-Aldrich (Canadá). ). Además, Sigma-Aldrich (Canadá) proporcionó un kit de ensayo de viabilidad de células vivas/muertas (CBA415), Hoechst 33342Nuclei Dye. Además, el anticuerpo Anti-Ki67 (ab15580), Alexa Fluor 546 Goat anti-Rabbit IgG (H + L) se adquirieron de Abcam e Invitrogen (Canadá), respectivamente.

Las células MDA-MB-231 se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10% y 100 Uml − 1 al 1% de penicilina/estreptomicina en matraces T-75. Las células se incubaron a 5 % de CO2 y 37 °C, y los medios se cambiaron cada dos días. Cuando las células alcanzaron el 80% de confluencia, las células se enjuagaron dos veces con DPBS y luego se suspendieron con tripsina/EDTA (0,25%-1X).

Para preparar la biotinta, de acuerdo con el protocolo proporcionado por Ouyang et al.38, se preparó una primera solución de NaCl al 0,5 % con agua desionizada. Luego, se añadieron gelatina y polvo de sal sódica del ácido algínico, y la solución se agitó vigorosamente durante 1 h. La solución preparada se esterilizó calentándola a 70 °C (30 min, tres veces) y luego se mantuvo a 4 °C antes de su uso. Antes de la bioimpresión, la suspensión de MDA-MB-231 se mezcló suave y uniformemente con una solución de gelatina/alginato preparada usando una jeringa mezcladora para hacer una biotinta con concentraciones finales de 4 % (\(p/v\)) de gelatina, 4 % (\ (w/v\)) alginato y 2–2,5 × 1 \({0}^{6}\) células MDA-MB-231 \({\mathrm{mL}}^{-1}\).

La bioimpresión se llevó a cabo utilizando la bioimpresora basada en extrusión CELLINK INCREDIBLE +. La biotinta preparada se extruyó con una aguja para fabricar las construcciones de cuadrícula en capas de hidrogel de células 3D. Más específicamente, la boquilla de impresión aplicada para este experimento era una boquilla cónica estándar (22G) y la velocidad de movimiento de la aguja se ajustó a 5 \(mm{s}^{-1}\). La impresión se realizó a temperatura ambiente aplicando la presión adecuada. La estructura se diseñó con el software Solidwork y se cortó en el software sli3r en 10 capas con el tamaño de \(10\times 10\times 3 m{m}^{3}\) con un patrón de relleno rectilíneo. Durante la impresión, hicimos un esfuerzo por mantener la presión al nivel más bajo para tener el mínimo daño a la viabilidad celular. Posteriormente, las construcciones cargadas de células se sumergieron en una solución estéril de cloruro de calcio al 3 % (\(p/v\)) (20 min) para entrecruzar el alginato de sodio con iones de calcio21. Luego, después de tres lavados con PBS, cada estructura se cultivó en medio DMEM que contenía 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina en una placa de 12 pocillos y se incubó a 5 % de CO2 y 37 °C durante un período de tiempo predeterminado. El medio de cultivo se cambió cada dos días.

La proliferación celular dentro de la red 3D se analizó utilizando el ensayo MTT. Después de los días predeterminados de incubación, se extrajo el medio de cada pocillo de una placa de 12 pocillos que contenía una estructura 3D y se extrajeron 900 \(\mu L\) de medio fresco y 100 \(\mu L\) de solución de MTT (0,5 \( {\mathrm{mg }mL}^{-1}\) en PBS) en cada pocillo y la placa se incubó durante 4 h a 37 °C en un \({\mathrm{CO}}_{2 }\) incubadora. El control era una estructura 3D sin células. Luego, después de aspirar el medio, se agregó 1 \(mL\) de DMSO en cada pocillo para disolver los cristales de formazán formados durante 30 min a 37 °C en una incubadora \({\mathrm{CO}}_{2}\) . Al final, la intensidad de los cristales de formazán solubilizados se registró utilizando el lector de microplacas de absorbancia a 540 nm.

Las construcciones cargadas de células bioimpresas en 3D se tiñeron en puntos de tiempo específicos usando el kit de viabilidad de tinción Live/Dead basado en las instrucciones del fabricante para determinar la viabilidad celular. Brevemente, cada construcción se lavó en PBS tres veces. Luego, se aplicaron 1 \(\mu M\) de calceína-AM y 2 \(\mu M\) de yoduro de propidio para teñir las células mientras se incubaban en la oscuridad. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser (Zeiss LSM 700) para obtener imágenes de las células vivas y muertas dentro de las construcciones 3D en múltiples puntos. Luego, las imágenes se analizaron utilizando el software ImageJ. La viabilidad celular se contó dividiendo el número de células verdes (vivas) por el número total de células en cada imagen.

El ensayo de proliferación celular Ki-67 es una técnica cuantitativa para evaluar la proliferación celular in vitro. Con este método, la proteína Ki-67 se aplica como marcador de proliferación celular tal como se expresa durante el ciclo celular activo (G1, S, G2 y M) pero no en la fase estacionaria (G0). Para realizar este ensayo, en primer lugar, se eliminó por completo el medio de cada pocillo en intervalos de tiempo predeterminados y cada armazón se lavó dos veces con PBS. Luego, las células se fijaron incubando andamios en paraformaldehído al 4% en PBS durante 1 ha temperatura ambiente. Las estructuras fijas se permeabilizaron en PBS que contenía 0,1–0,25 % de Triton X-100 durante 15 min después de lavarse con PBS dos veces. Posteriormente, las células se bloquearon con BSA al 3 %/Triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 1 h antes de agregar el anticuerpo Anti-Ki67 con la concentración de 5 \({\mathrm{\mu gmL}}^{-1} \) en PBS/BSA al 1 % e incubación durante la noche a 4 °C. A continuación, las estructuras 3D se lavaron tres veces durante 5 min con PBS/BSA al 1 % antes de añadir el anticuerpo secundario IgG (H + L) anti-conejo de cabra e incubar durante 2 h. A continuación, las estructuras se volvieron a lavar (dos veces, 5 min) con PBS/BSA antes de añadir Hoechst 33,342 (incubación de 1 h). Finalmente, se tomaron imágenes de las células utilizando el microscopio confocal de barrido láser.

Este modelo simula el tiempo como pasos de tiempo discretos y uniformes; cada paso de tiempo es de 1 h, y cada simulación dura 11 días. En este modelo se simula un subdominio del andamio cargado de células porosas fabricado con el método de bioimpresión 3D, que comprende una red cuadrada de 190 \(\times \) 190 \(\times 30\) puntos de red, que consta simétricamente de cuatro poros con anchos de 50 \(\times \) 50 \(\times 30\) puntos de red. Cada punto de la red dentro del hidrogel puede estar ocupado por una celda o permanecer vacío, mientras que los puntos de la cuadrícula en los poros deben permanecer desocupados, ya que las celdas en los experimentos in vitro correspondientes no se mueven hacia los poros (Material complementario, Figura S2) . Se instancia una simulación colocando un número inicial específico de células en ubicaciones aleatorias en la red dentro del hidrogel. En cada paso de tiempo, las células se comportan de acuerdo con un conjunto de reglas estocásticas que describen procesos celulares como la proliferación, el movimiento y la muerte. El algoritmo principal y el cronograma de procesos dentro de cada paso de tiempo en la bioimpresión se representan en la Fig. 9. El marco computacional se basa en el trabajo teórico previo de población celular40,41. En el Material complementario (Material complementario, estudios in-silico) se proporciona una descripción detallada del modelo, formulada utilizando el protocolo Descripción general, conceptos de diseño y detalles (ODD).

Pasos principales en la bioimpresión in vitro e in-silico.

Este proceso se simula para cada celda individualmente para considerar las variaciones entre celdas. Las celdas individuales se caracterizan por un tiempo de duplicación estocástico específico, que se atribuye al tiempo que tarda cada celda en completar un ciclo celular para dividirse. Según nuestros datos experimentales, el tiempo de duplicación de cada celda se toma de una distribución normal con un valor µ = 96 h y una desviación estándar σ = 6 h. El proceso del ciclo celular modelado en la proliferación consiste en transiciones entre las fases proliferativas y no proliferativas (G0). Después de dividirse, las células madre permanecen en su posición actual y las células hijas se pueden colocar en un punto de red desocupado en la vecindad de la madre. Si todos los sitios vecinos ya están ocupados, las células madre entran en la fase G0, conocida como fase de reposo o quiescencia, en la que las células se vuelven inactivas42. Los vecindarios de Moore de primer, segundo y tercer orden se utilizan para colocar celdas hijas. El andamio tiene una capacidad de carga máxima especificada \(C\) para alojar células, y al alcanzar el número total de células para esta capacidad, la proliferación aborta con una probabilidad especificada (\({P}_{0}\)). La capacidad de carga depende de las limitaciones espaciales y de nutrientes en el sistema in vitro. Los valores de \(C\) y \({P}_{0}\) se calibran según las observaciones in vitro. Debido a la distribución desigual de nutrientes y oxígeno dentro del andamio, algunas células aún pueden proliferar después de alcanzar la capacidad de carga del andamio, mientras que otras entran en la fase G0. Esto significa que las células pueden continuar proliferando en sitios con suficientes nutrientes y puntos reticulares vecinos libres. La tabla S1 contiene los valores de todos los parámetros in-silico.

En el proceso de movimiento, las celdas se mueven cada vez que se conoce como \({m}_{c}\), sin embargo, como todas las celdas pueden no estar sincronizadas en su movimiento, se introdujo un número aleatorio para agregar a \({m} _{C}\). El valor del parámetro \({m}_{c}\) también se calibró utilizando datos in vitro. En este proceso, las celdas individuales pueden moverse de manera aleatoria con probabilidad aleatoria, o de manera aleatoria sesgada con probabilidad sesgada, y cambiar sus posiciones si hay un punto de red libre en su vecindad34. Las celdas pueden moverse hacia una de las seis direcciones (derecha, izquierda, arriba, abajo, adelante y atrás) de su vecindad con igual probabilidad, lo que se conoce como movimiento aleatorio, o moverse de manera aleatoria sesgada con probabilidad ponderada, donde las celdas son atraídos por otras células y los poros en su vecindad, motivados por observaciones empíricas de los experimentos in vitro. En el movimiento aleatorio sesgado, calculamos la probabilidad de movimiento en cada dirección (dirección-p) dependiendo del número de celdas vecinas en esa dirección de una celda dentro de su rango de atracción, definida como (\({L}_{ C}\)). Además, la probabilidad en cada dirección puede incrementarse dependiendo de la distancia euclidiana entre el individuo y los poros dentro de un rango de atracción específico conocido como (\({L}_{p}\)). En el caso de movimiento aleatorio, \({P}_{\mathrm{arriba}}={P}_{\mathrm{abajo}}={P}_{\mathrm{izquierda}}={P}_{\ mathrm{right}}={P}_{\mathrm{forward}}={P}_{\mathrm{backward}}=1/6\), donde 6 es el número de direcciones, y \({P} _{\mathrm{arriba}}\), \({P}_{\mathrm{abajo}}\), \({P}_{\mathrm{izquierda}}\) \({P}_{\ mathrm{right}}\) , \({P}_{forward}\) , y \({P}_{\mathrm{backward}}\) son la probabilidad de movimiento de celda hacia arriba, abajo, izquierda y dirección correcta, respectivamente. En el caso de sesgo aleatorio, \({P}_{\mathrm{arriba}}={P}_{1}\), \({P}_{\mathrm{abajo}}={P}_{ 2}\), \({P}_{\mathrm{derecha}}={P}_{3}\), \({P}_{\mathrm{izquierda}}={P}_{4} \), \({P}_{hacia delante}={P}_{5}\) y \({P}_{hacia atrás}={P}_{6}\), con \({\sum }_{i=1}^{6}{P}_{i}=1\). Las probabilidades \({P}_{i}\) se calculan escaneando y sumando las celdas vecinas y los puntos de la red de poros. Se describen más detalles en el Material complementario. Finalmente, cada celda se mueve con más tendencia en la dirección donde se calcula la mayor probabilidad.

En las simulaciones, asumimos que la estructura porosa del andamio bioimpreso en 3D permitía que todas las células accedieran a nutrientes y oxígeno, lo que evitaba la muerte por falta de estos materiales vitales. Sin embargo, las células pierden su viabilidad si permanecen en la fase estacionaria por más de un tiempo específico definido como \({C}_{d}\), calibrado dentro de un rango de valores, con la probabilidad de \({P}_ {d}\). La tabla S1 contiene los valores de todos los parámetros in-silico.

Se utilizó el software Image J para analizar las imágenes. Todas las barras de error en las figuras y los datos informados indicaron ± SD de al menos tres repeticiones (n ≥ 3). Los resultados se informaron en formato de media ± DE. Las estadísticas informadas de las imágenes de microscopía confocal se obtuvieron promediando el número de células en al menos cinco puntos distintos de cada estructura.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente, Dorsa Mohammadrezaei, previa solicitud razonable.

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Se agradece el apoyo financiero de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (DM, MK).

Departamento de Matemáticas Aplicadas, Universidad de Waterloo, 200 University Ave West, Waterloo, ON, N2L 3G1, Canadá

Dorsa Mohammadrezaei, Nafiseh Moghimi, Shadi Vandvajdi y Mohammad Kohandel

Departamento de Matemáticas, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad de Swansea, Swansea, Reino Unido

Gibin Powathil

Escuela de Matemáticas y Estadística, Universidad de St Andrews, St Andrews, Reino Unido

sara hamis

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DM: Concibió y diseñó el análisis, desarrolló el código in silico, realizó y analizó los experimentos in vitro e in silico y redactó el manuscrito. NM: asesoró a los experimentos in vitro. SV: realizado en experimentos silico. GP: Concibió y diseñó el análisis, asesoró el proyecto y revisó el manuscrito. SH: Concibió y diseñó el estudio, aconsejó los experimentos in silico y desarrolló el marco computacional, y revisó el manuscrito. MK: Concibió y diseñó el análisis, supervisó el proyecto y revisó el manuscrito.

Correspondencia a Dorsa Mohammadrezaei.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Información complementaria 1.

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Reimpresiones y permisos

Mohammadrezaei, D., Moghimi, N., Vandvajdi, S. et al. Predecir y dilucidar el comportamiento posterior a la impresión de células cancerosas impresas en 3D en estructuras de hidrogel mediante la integración de experimentos in vitro e in-silico. Informe científico 13, 1211 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28286-9

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Recibido: 13 Agosto 2022

Aceptado: 16 enero 2023

Publicado: 21 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28286-9

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