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Células senescentes RANKL+ bajo estrés mecánico: una diana terapéutica para la reabsorción radicular en ortodoncia utilizando senolíticos

Mar 23, 2023

International Journal of Oral Science volumen 15, Número de artículo: 20 (2023) Citar este artículo

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En odontología, la reabsorción radicular ortodóncica es un problema de larga duración sin una estrategia de tratamiento eficaz, y sus mecanismos, especialmente los relacionados con las células senescentes, siguen siendo en gran parte desconocidos. Aquí, utilizamos un modelo de movimiento dental de intrusión de ortodoncia con un bucle en L en ratas para demostrar que las células senescentes inducidas por estrés mecánico agravan la reabsorción de la raíz apical, que se evitó mediante la administración de senolíticos (un cóctel de dasatinib y quercetina). Nuestros resultados indicaron que los cementoblastos y las células del ligamento periodontal sufrieron senescencia celular (p21+ o p16+) y expresaron fuertemente el activador del receptor del factor nuclear kappa B (RANKL) desde el día tres, induciendo posteriormente odontoclastos positivos a la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y provocando reabsorción radicular apical. Más células senescentes p21+ expresaron RANKL que células senescentes p16+. Observamos solo cambios menores en el número de células no senescentes RANKL+, mientras que las células senescentes RANKL+ aumentaron notablemente a partir del día siete. Curiosamente, también encontramos células de catepsina K+p21+p16+ en la fosa de reabsorción de la raíz, lo que sugiere odontoclastos senescentes. La administración oral de dasatinib y quercetina redujo notablemente estas células senescentes y las células TRAP+, y finalmente alivió la reabsorción radicular. En conjunto, estos resultados revelan esos estímulos aberrantes en las células senescentes tempranas RANKL+ inducidas por el movimiento dental intrusivo ortodóncico, que tienen un papel fundamental en la odontoclastogénesis y la posterior reabsorción radicular. Estos hallazgos ofrecen un nuevo objetivo terapéutico para prevenir la reabsorción radicular durante el movimiento dental ortodóncico.

La reabsorción de la raíz apical durante el tratamiento de ortodoncia comúnmente afecta a los ortodoncistas. Por ejemplo, en algunos estudios previos, las tasas de incidencia de reabsorción radicular se alcanzaron en 90% y 100%.1 Además, la reabsorción apical de la raíz de moderada a severa ocurre en el 12% al 17% de los pacientes de ortodoncia, provocando ocasionalmente el efecto secundario clínico no deseado. , pérdida de dientes.2 Sin embargo, actualmente no existen terapias preventivas efectivas. Por lo tanto, se requiere explorar los objetivos terapéuticos velados basados ​​​​en mecanismos novedosos.

La reabsorción radicular es un mecanismo complejo subyacente a una orquesta de activación celular no fisiológica y movilización de numerosas células.3 Al igual que los osteoclastos asociados con la reabsorción ósea, los odontoclastos emergen para reabsorber las superficies radiculares.4,5 El receptor activador del factor nuclear kappa B ligando (RANKL)/vía relacionada con RANK es una de las vías clásicas que promueve vigorosamente la inducción y activación de odontoclastos y la osteoclastogénesis.3 Varios tipos de células, como los cementoblastos y las células del ligamento periodontal (PDL), expresan este ligando.6,7 Además, múltiples factores estresantes facilitan la expresión de RANKL, incluida la inflamación, las especies reactivas de oxígeno (ROS) y el estrés mecánico no fisiológico.8,9 Por ejemplo, una línea celular de cementoblastos humanos inmortalizados y células PDL expresan significativamente RANKL bajo estrés;10,11 ,12,13,14 El movimiento dental ortodóncico (OTM, por sus siglas en inglés) activa los cementoblastos para inducir la expresión de RANKL.15,16 Por lo tanto, considerando las similitudes entre la osteoclastogénesis y la odontoclastogénesis,17 los fármacos para la osteoporosis (p. ej., bisfosfato, que provoca la muerte celular directa, y denosumab, un anticuerpo anti-RANKL que previene la formación de osteoclastos) se han investigado exclusivamente para tratar la reabsorción radicular.18,19 Sin embargo, hasta el momento, estos fármacos aún no han alcanzado la aplicación clínica.

La senescencia celular es inevitable para las células envejecidas, lo que resulta en una detención irreversible de la proliferación, fuertes señales mitogénicas, telómeros acortados, daño en el ADN y aumento de ROS in vitro e in vivo.20,21 En particular, el daño en el ADN juega un papel crucial en el estrés prematuro inducido senescencia, provocada por varios factores de estrés, como agentes mecánicos, oxidativos, de radiación y genotóxicos.22,23,24,25 Incluso en odontología, se ha informado senescencia celular inducida por etanol en cementoblastos y células del ligamento periodontal.26 Otros investigadores también han demostraron que los cementoblastos sufren senescencia celular e inhibición de la calcificación en respuesta a estímulos de estrés mecánico.27 Las células senescentes generalmente activan cascadas de factores de transcripción, como p53/p21CIP1, una vía involucrada en la represión del ciclo celular, y p16INK4A/RB.28,29 Por lo tanto, p21 y p16 son marcadores muy utilizados para detectar células senescentes.30,31 Además, los rápidos avances en los estudios de senescencia celular han revelado que las células senescentes están implicadas en diversas enfermedades relacionadas con la edad e influyen en la esperanza de vida al secretar fenotipos secretores asociados a la senescencia, incluidas sustancias inflamatorias32 que deterioran los tejidos circundantes.33

En 2015, se identificó un cóctel de fármacos compuesto por dasatinib (inhibidor de la tirosina cinasa; utilizado para tratar la leucemia mieloide crónica) y quercetina (un flavonoide de origen vegetal) como un agente inductor de muerte celular específico (es decir, un senolítico) para las células senescentes. (en adelante, dasatinib y quercetina [D+Q])34. Desde entonces, se ha comprobado su eficacia en diversas enfermedades, como la diabetes, la enfermedad de Alzheimer35 y la osteoporosis36, y para restaurar la regeneración ósea37. Ensayos de viabilidad clínica y desarrollo de otros senolíticos están progresando continuamente.38,39 En consecuencia, las células senescentes ahora se reconocen como objetivos terapéuticos para varias enfermedades.20 Por lo tanto, las células senescentes son un objetivo terapéutico potencial para prevenir la reabsorción de la raíz. Sin embargo, poco se sabe sobre la asociación y localización de células senescentes bajo OTM y su función en la reabsorción radicular.

Aquí, mostramos que el estrés mecánico nocivo por OTM induce cementoblastos senescentes RANKL-positivos (RANKL+) y células PDL, lo que exacerba la reabsorción radicular en molares de rata utilizando un modelo de movimiento dental intrusivo de ortodoncia con un bucle en L. Además, verificamos que la administración oral de D + Q redujo notablemente el número de células senescentes RANKL+, atenuando la reabsorción radicular, lo que indica que las células senescentes inducidas por estrés mecánico son un objetivo potencial para la terapia de reabsorción radicular.

Para imitar la reabsorción de la raíz apical, primero establecimos un modelo OTM de rata con un bucle en L verticalmente hacia abajo que se muestra en las Figs. 1a, b. Un bucle en L es un aparato convencional utilizado en el tratamiento de ortodoncia que genera las fuerzas y los momentos deseados para mover los dientes de forma predecible. En consecuencia, la fuerza se propaga directamente al ápice y al tejido del PDL como tensión mecánica. Los primeros molares superiores izquierdos (M1s) se sometieron a una fuerza mecánica (5 N) aplicada verticalmente hacia abajo de forma continua durante 14 días (Fig. 1c, d). Las ratas sin tratamiento con bucle en L se usaron como grupo de control (Fig. 1c, Fig. S1). El análisis de microtomografía computarizada (µ-CT) no mostró movimiento dental en el grupo de control después de 14 días (Fig. S1a), mientras que los M1 se movieron significativamente verticalmente hacia abajo después del día 5 con el bucle en L, lo que indica que OTM causó con éxito fuerza mecánica y tensión en los tejidos periapicales (Fig. 1d, e).

El modelo de intrusión dental de ortodoncia en ratas. a Un diagrama esquemático del sistema de fuerza de bucle en L en el modelo de movimiento de dientes de ortodoncia (OTM). Líneas azules horizontales: patas de bucle en L en la etapa inactiva. Después de agregar fuerza vertical (5 N: flecha roja) a las patas del bucle en L usando resina, el M1 izquierdo se somete a la fuerza vertical (flecha verde) mediante efectos de palanca (círculos rojos). M1: primer molar, M2: segundo molar, M3: tercer molar. b Imágenes macroscópicas del modelo con el bucle en L desde el lado bucal (izquierda) y frontal (bajo y alto aumento: imágenes media y derecha, respectivamente). c Un diagrama de flujo de un experimento con animales (n = 4 por grupo). D dasatinib, Q quercetina. d Imágenes reconstruidas de microtomografía computarizada (μ-CT) de los molares superiores izquierdos. Líneas blancas: la línea de base para medir la distancia OTM de M1. Flecha amarilla de dos sentidos: la distancia desde la cúspide de M1 hasta la línea básica. e Un análisis cuantitativo de la distancia OTM desde (d), representada como medias ± desviaciones estándar. ****P < 0,000 1; ns no significativo

Posteriormente, para investigar si el modelo OTM podría causar reabsorción radicular, evaluamos el ápice de la raíz mesial de M1 usando µ-CT y tinción histológica, incluida la tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) para la detección de odontoclastos. Las imágenes de reconstrucción tridimensionales (3D) y μ-CT de alta resolución revelaron que la morfología de la superficie apical de la raíz cambió de manera dependiente del tiempo, volviéndose irregular bajo estrés (Fig. 2a). Además, el análisis cuantitativo de µ-CT mostró que la densidad mineral apical media de la raíz (RMD) disminuyó significativamente desde el día 5 de estrés (Fig. 2c). La tinción TRAP no identificó odontoclastos (es decir, células TRAP+) en el grupo de control (Fig. S1b). Sin embargo, en el grupo OTM, aparecieron odontoclastos en la superficie de la raíz a partir del día 3 de estrés, aunque los números fueron pocos (Fig. 2b, flechas negras). Por el contrario, aparecieron más osteoclastos (células TRAP+: Fig. 2b, e, puntas de flecha negras) en la superficie del hueso alveolar a partir del día 3 de estrés. Los odontoclastos aumentaron rápidamente a partir del día 5 de estrés, coincidiendo con el inicio de la reabsorción radicular (Fig. 2b, d ). Las imágenes de tinción con hematoxilina-eosina (HE) indicaron que se produjo una reabsorción radical severa en el ápice desde el día 7 al 14 de estrés (Fig. 2b, puntas de flecha blancas).

Reabsorción radicular apical en dientes de ratas sometidas a estrés mecánico. Imágenes de μ-CT y reconstrucción tridimensional del ápice de la raíz mesial del primer molar superior izquierdo. b Imágenes de raíz mesial de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y tinción de hematoxilina-eosina después de aplicar estrés mecánico. Flechas negras: células odontoclásticas TRAP+. Puntas de flecha negras: osteoclastos TRAP+. Ab hueso alveolar. Puntas de flecha blancas: fosa de reabsorción radicular. c Densidad mineral radicular (RMD) del ápice radicular mesial. d Números de odontoclastos TRAP+ en las superficies radiculares. e Números de osteoclastos TRAP+ en la superficie del hueso alveolar. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. **P < 0,01, ***P < 0,001, ns no significativo. Barras de escala: 100 μm para (a) y 250 μm para (b). Sin número

La estimulación del estrés mecánico induce la senescencia celular de los cementoblastos y las células del PDL26,27 y aumenta la expresión de RANKL,40,41,42 que están potencialmente asociados con la reabsorción de la raíz. Por lo tanto, verificamos la localización de las células positivas para la proteína de unión al cemento (CAP) que expresan marcadores de senescencia (p21 y p16) y RANKL mediante tinción de inmunofluorescencia (Figs. 3a, 4a y S2a). Además, usando Ki-67 (un conocido marcador de proliferación) y tinción TUNEL (utilizable para la detección de daños en el ADN y apoptosis), confirmamos la senescencia celular y los daños en el ADN (Figs. S3 y S4). Los cementoblastos y las células PDL secretan CAP; por lo tanto, se usó CAP para identificarlos.43,44,45,46 De aquí en adelante, definimos las células CAP+ en la superficie de la raíz como cementoblastos y las células CAP+ en PDL como células PDL.

Células RANKL+ y células senescentes p21+ en tejidos periapicales bajo estrés mecánico. a Tinción de inmunofluorescencia y colocalización de la proteína de unión al cemento (CAP) y el activador del receptor del ligando kappa-Β del factor nuclear (RANKL) con p21 bajo la contratinción de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en tejidos periapicales después de aplicando tensión mecánica. Núcleo: azul (DAPI); GORRO: verde; RANKL: blanco; p21: rojo. Barras de escala: 100 y 25 μm para bajo y alto aumento, respectivamente. Las flechas blancas y la línea discontinua naranja en (a) indican el área de la fosa de reabsorción de la raíz. Ligamento periodontal del PDL. a1 Células reactivas a la fluorescencia en la fosa de reabsorción de la raíz. Barra de escala: 10 μm

Células RANKL+ y células senescentes p16+ en tejidos periapicales bajo estrés mecánico. a Tinción de inmunofluorescencia y colocalización de la proteína de unión al cemento (CAP) y RANKL con p16 bajo la contratinción DAPI en tejidos periapicales después de aplicar estrés mecánico. Núcleo: azul (DAPI); GORRO: verde; RANKL: blanco; p16: rojo. Barras de escala: 100 y 25 μm para bajo y alto aumento, respectivamente. Las flechas blancas y la línea discontinua naranja en (a) indican el área de la fosa de reabsorción de la raíz. Ligamento periodontal del PDL. a1 Células reactivas a la fluorescencia en la fosa de reabsorción de la raíz. Barra de escala: 10 μm

Las Figuras 3 a 5, Figuras S1c y S2a muestran las distribuciones espaciotemporales de las células que expresan CAP, RANKL, p21 o p16 en los tejidos periapicales y los números cuantificados. En el grupo de control, no se observaron cementoblastos y células PDL que expresaran RANKL o p21 después de 14 días sin OTM (Fig. S1c). Por el contrario, las células RANKL+, p21+ y p16+ aparecieron en los tejidos periapicales bajo estrés mecánico (Figs. 3, 4 y Fig. S2a). El número de células proliferativas disminuyó en paralelo al aumento de los marcadores p21 (Fig. S3), mientras que las células dañadas por el ADN (células TUNEL+) aumentaron (Fig. S4) bajo el estrés mecánico. Los cementoblastos RANKL+ y las células PDL RANKL+ (es decir, RANKL+CAP+) aparecieron a partir del día de estrés 3 y aumentaron notablemente en los días de estrés 5 y 7 (Fig. 5a). De manera similar, los cementoblastos senescentes y las células PDL (células p21+CAP+ o p16+CAP+) aumentaron de los días de estrés 3 a 7 (Fig. 5b, c). Aunque no pudimos comparar directamente los números absolutos de células p21+ y p16+ debido a las diferentes secciones, podemos concluir que el número de células p21+ aumentó antes que las células p16+ dada la diferencia estadística por sección. Entre estas células senescentes encontramos cementoblastos RANKL+ y células PDL en los tejidos periapicales (Figs. 3 y 4). Las Figuras 3a1 y 4a1 presentan cementoblastos senescentes RANKL+ representativos en la fosa de resorción radicular.

Se analizó la proporción de cementoblastos y PDL senescentes (p21+ o p16+) o RANKL+ en tejidos periapicales. a El número de cementoblastos RANKL+ o células PDL RANKL+ en los tejidos periapicales. Cementoblastos: células CAP+ en la superficie de la raíz; Células PDL: Células CAP+ en PDL. b, c El número de cementoblastos p21+ o p16+ o células PDL en los tejidos periapicales. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns no significativo. Sin número

Para diseccionar el carácter de los cementoblastos o células PDL (células CAP+) bajo estrés mecánico, clasificamos cada célula según la expresión de marcadores senescentes (p21 y p16) y RANKL (Figs. 6 y 7 para cementoblastos y células PDL, respectivamente). En los cementoblastos senescentes (p21+ o p16+; círculos rojos rotos en la Fig. 6a–c), las células RANKL+ aumentaron con el tiempo hasta el día 7 de estrés, mientras que las células RANKL– solo tuvieron cambios menores (Fig. 6b, c); estos resultados sugieren que la mayoría de los cementoblastos senescentes expresaron RANKL. Mientras tanto, en las células PDL senescentes (p21+ o p16+; círculos rojos rotos en la Fig. 7a-c), las células senescentes RANKL+ y RANKL– aumentaron de manera similar hasta el día 7 de estrés. Aunque no pudimos dilucidar las razones de las diferencias anteriores, estos resultados demuestran que los cementoblastos senescentes y las células PDL expresan RANKL de manera sensible en respuesta al estrés mecánico en el tejido periapical.

Clasificación de RANKL+ o cementoblastos senescentes en tejidos periapicales bajo movimiento dental ortodóncico (es decir, estrés mecánico). a Diagramas esquemáticos de RANKL+ o cementoblastos senescentes bajo estrés mecánico. Círculos rojos rotos: células senescentes que expresan o no expresan RANKL de (b) y (c). Círculos azules discontinuos: células RANKL+ que expresan o no expresan marcadores senescentes (p21 o p16) de (d) y (e). b, c Expresión de RANKL en cementoblastos senescentes (p21+/CAP+/DAPI o p16+/CAP+/DAPI). d, e Expresión del marcador de senescencia (p21 o p16) en cementoblastos RANKL+ (RANKL+/CAP+/DAPI). Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns no significativo. Sin número

Clasificación de RANKL+ o células PDL senescentes en tejidos periapicales bajo movimiento dental ortodóncico (es decir, estrés mecánico). a Diagramas esquemáticos de RANKL+ o células PDL senescentes bajo estrés mecánico. Círculos rojos rotos: células senescentes que expresan o no expresan RANKL de (b) y (c). Círculos azules discontinuos: células RANKL+ que expresan o no expresan marcadores senescentes (p21 o p16) de (d) y (e). b, c Expresión de RANKL en células PDL senescentes (p21+/CAP+/DAPI o p16+/CAP+/DAPI). d, e Expresión del marcador senescent (p21 o p16) en células RANKL+ PDL (RANKL+/CAP+/DAPI). Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns no significativo. Sin número

A continuación, analizamos la proporción de células senescentes (p21+ o p16+) en cementoblastos RANKL+ (círculos azules rotos en la Fig. 6a, d, e). El número de células p21– y p21+ no difirió hasta el día 5 de estrés, luego las células p21+ aumentaron notablemente desde el día 7 de estrés (Fig. 6d). Mientras tanto, el número de células p16+ fue consistentemente menor que el número de células p16– hasta el día 14 de estrés. Cabe destacar que las células p21– representan células no senescentes porque p21 es un conocido productor de senescencia temprana.47 Sin embargo, las células p16– son no siempre células no senescentes porque también incluyen células senescentes tempranas p21+; Las expresiones de p21 y p16 se superponen en la senescencia tardía.47 La propensión de las células del PDL senescentes bajo estrés mecánico es consistente con el resultado del cementoblasto senescente (Fig. 7d, e). En conjunto, RANKL se expresó principalmente en células senescentes p21+ en lugar de células no senescentes y células p16+.

Para probar si el odontoclasto experimentó senescencia celular, teñimos las secciones de tejidos periapicales usando un anticuerpo para un marcador de odontoclastos (catepsina K) con marcadores senescentes (p21 y p16). Curiosamente, encontramos células multinucleares de catepsina K+p21+p16+ en la fosa de reabsorción de la raíz (Figs. 8 y S2b), pero no en grupos libres de estrés en el día 14 (Fig. S5).

Odontoclastos senescentes en la fosa de reabsorción radicular. Imágenes de inmunofluorescencia de los sitios de reabsorción de la raíz teñidos con catepsina K, p21, p16 y DAPI después de 14 días de estrés mecánico. Núcleo: azul (DAPI); catepsina K: blanco; p21: rojo; p16: verde. Barra de escala = 100 μm y 25 μm para aumento bajo y alto, respectivamente. Las flechas blancas y la línea discontinua naranja indican el área de reabsorción radicular. Hueso alveolar abdominal

Para aclarar la función de los cementoblastos senescentes RANKL+ y las células PDL para la reabsorción de la raíz del diente, administramos por vía oral un senolítico (D + Q) a las ratas bajo estrés mecánico los días 1 y 7 (Fig. 1c). La dosis senolítica se definió a partir de estudios previos.48 El número de células RANKL+ senescentes (p21+ o p16+) y células de catepsina K+p21+p16+ disminuyó significativamente en el grupo D + Q (Figs. 9a, b y S6) desde la superficie de la raíz; el número de células Ki67+ (células de proliferación) se restauró, mientras que las células TUNEL+ (células apoptóticas) aumentaron (Figs. S3 y S4). El número total de cementoblastos y células PDL también disminuyó en los tejidos periapicales (Fig. 9c). Además, las células TRAP+ y las células multinucleares de catepsina K+p21+p16+ disminuyeron significativamente desde la superficie de la raíz (Figs. 9d, f y S6). Sin embargo, todavía identificamos células TRAP+ y catepsina K+ (pero no p21+p16+) en el hueso alveolar (Figs. 9d y S6) a pesar de que las células senescentes estaban disminuidas (Fig. S6) y en algunas partes estaban co-localizadas cerca de los osteoclastos bajo el estrés mecánico (Fig. S7). Imágenes de µ-CT de alta resolución con reconstrucción 3D y análisis cuantitativos determinaron que las raíces tenían una superficie más lisa con la administración de D+Q que sin D+Q. La RMD de la porción apical proximal fue mayor en el grupo D+Q que en el grupo sin D + Q (Fig. 9e, f). El movimiento dentario después de la administración de D+Q disminuyó a aproximadamente un 50% (Fig. 10). El resultado indica que la administración oral de senolíticos atenuó eficazmente la reabsorción radicular que se produce bajo estrés mecánico mediante la eliminación de las células senescentes RANKL+ (Fig. 11), mientras que se requiere una aclaración más detallada y una mejora cautelosa para promover esta terapia para uso clínico.

La administración oral de senolíticos impidió la reabsorción radicular. Las ratas se trataron con dasatinib (D) + quercetina (Q) o se dejaron sin tratar los días 1 y 7 durante el movimiento ortodóntico de los dientes (es decir, estrés mecánico) durante 14 días. a Imágenes de inmunofluorescencia de los tejidos periapicales teñidos con CAP, RANKL, p21, p16 y DAPI. Núcleo: azul (DAPI), RANKL: blanco; GORRO: verde; p21 o p16: rojo. Barra de escala = 100 μm y 25 μm para aumento bajo y alto, respectivamente. b El número de cementoblastos RANKL+p21+ y células PDL o cementoblastos RANKL+p16+ y células PDL en los tejidos periapicales. c Cementoblastos y células PDL (células CAP+) en los tejidos periapicales. d Tinción TRAP e imágenes de μ-CT del ápice de la raíz mesial. Barras de escala: 100 μm para imágenes μ-CT y 250 μm para tinción TRAP. e Imágenes de reconstrucción tridimensional del ápice de la raíz mesial del primer molar superior izquierdo. f El número de células TRAP+ en los ápices y la densidad mineral de la raíz (RMD) de los ápices de la raíz mesial. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,000 1. Sin número

Movimiento dental con o sin administración de D + Q en el día 14. Las ratas fueron tratadas con D + Q o no tratadas en los días 1 y 7 durante el movimiento dental ortodóncico (es decir, estrés mecánico) durante 14 días (Fig. 1c). a Imágenes reconstruidas de μ-CT de los molares superiores izquierdos. Líneas blancas: la línea de base para medir la distancia OTM de M1. Flecha amarilla de dos sentidos: la distancia desde la cúspide de M1 hasta la línea básica. Barra de escala: 1 mm. b Un análisis cuantitativo de la distancia OTM. Los datos se representan como medias ± desviaciones estándar. ****P < 0.000 1

Diagrama esquemático que ilustra la prevención de la reabsorción radicular usando dasatinib y quercetina después de los movimientos dentales de ortodoncia

Encontramos células senescentes RANKL+ y odontoclastos TRAP+ alrededor de la raíz apical con OTM. La administración oral repetitiva de D + Q disminuyó el número de esas células y atenuó notablemente la reabsorción radicular. Estos resultados indican que la senescencia inducida por estrés mecánico juega un papel crucial en la reabsorción de la raíz, que se puede prevenir con senolíticos.

En este estudio, inducimos con éxito fuerzas verticales y estrés mecánico en los M1 maxilares izquierdos de ratas usando un bucle en L (Fig. 1). Los OTM se han imitado en numerosos estudios con varios modelos experimentales, como modelos de movimiento de dientes horizontales que utilizan cadenas elásticas, 49 resortes de espiral cerrados, 50 y dispositivos de tipo hélice cuádruple, 51 entre otros. 52 Sin embargo, estos modelos experimentales han inducido principalmente movimiento dentario horizontal. Mientras tanto, solo unos pocos estudios han intentado desarrollar un modelo de movimiento dental de intrusión para inducir la reabsorción radicular en las puntas de las raíces,52,53 a pesar de que los tratamientos de ortodoncia a menudo utilizan el movimiento dental vertical que genera una fuerza de intrusión. En el movimiento dental vertical, la raíz apical y los tejidos periodontales se someten a una gran tensión mecánica, lo que eleva el riesgo de reabsorción radicular54,55 Después de la reabsorción radicular temporal y la subsiguiente restauración con cemento,56 la punta de la raíz se aplana gradualmente y no recupera completamente su longitud.57 Como Como resultado, hay más severidad en la reabsorción de la raíz apical que en la reabsorción de la raíz lateral.58 En consecuencia, preparamos un modelo de movimiento de intrusión dental que demostró ser una plataforma valiosa para dilucidar los mecanismos subyacentes a la reabsorción de la raíz apical. Nuestro modelo preparado solo necesita alambre de acero inoxidable y es fácil colocar los bucles en los dientes. Mientras tanto, la preparación de la forma de bucle en L requiere habilidades de ortodoncia.

Nuestros análisis histológicos y de µ-CT mostraron que la reabsorción apical severa de la raíz comenzó alrededor del día 5 de estrés (Fig. 2a, b). Curiosamente, la resorción de la raíz apical se retrasó debido a la resorción ósea con OTM (Fig. 2a). Además, comenzaron a aparecer más osteoclastos TRAP+ que odontoclastos TRAP+ en el hueso alveolar el día 3 de estrés (Fig. 2b, d, e). Aunque varios investigadores han estudiado odontoclastos y osteoclastos in vivo e in vitro,59 la diferencia en la formación de esos dos tipos de células in vivo sigue sin estar del todo clara. Estudios previos han reportado que los cementoblastos estimulados mecánicamente expresan menos RANKL que los osteoblastos,10 y la susceptibilidad a la estimulación mecánica difiere en cementoblastos y osteocitos.60 Además, la distancia a la médula ósea, donde estarían los monocitos (origen de odontoclastos y osteoclastos), podría estar parcialmente asociado con el tiempo de retraso entre la resorción de la raíz apical y la resorción ósea.

Aunque p21 y p16 son marcadores significativos relacionados con la senescencia, su cinética de expresión difiere61. En nuestro estudio, las células p21+ aparecieron antes que las células p16+ en los tejidos periapicales sometidos a estrés mecánico vertical (Figs. 3, 4 y 5). Estudios previos informaron que los incrementos de la expresión de p21 disminuyeron drásticamente al alcanzar la senescencia celular, mientras que los de p16 continuaron durante un período y luego aumentaron al final de la vida celular y al comienzo de la diferenciación.47 Por lo tanto, algunos han propuesto recientemente que p21 es un marcador de senescencia temprana y p16 es un marcador de senescencia tardía.47 Además, informes más recientes indican que los cementoblastos estimulados por estrés mecánico expresan lincRNA-p21,27 un factor crítico que regula la apoptosis y la proliferación celular al reprimir la traducción de genes diana a través de la vía de señalización de p5362 (la vía principal que regula la expresión de p2161). Dado que p21 se expresó consistentemente más alto que p16 desde el día 3 en nuestro estudio, nuestros datos proporcionan evidencia de que el estrés mecánico inducido por OTM también produce células senescentes en el orden de p21 a p16, incluso in vivo (Fig. 5).

Estudios previos han demostrado que los cementoblastos y las células del PDL producen potencialmente RANKL bajo estímulos de estrés mecánico in vitro.12,16 La alta expresión de RANKL promueve la conversión de las células del linaje de monocitos y macrófagos en preodontoclastos y aumenta la actividad de reabsorción de la raíz.3 En nuestro estudio, el el número de células RANKL+ no senescentes (p21–) y células RANKL+ senescentes (p21+) no difirió hasta el día 5 de estrés, pero observamos diferencias notables desde el día 7 de estrés (Figs. 6d, 7d). Estos resultados sugieren que las células RANKL+ no senescentes y senescentes RANKL+ contribuyen al inicio de la odontoclastogénesis. Sin embargo, este último posiblemente juegue un papel esencial en el agravamiento o maduración de esta formación. De hecho, eliminamos la mayoría de los odontoclastos TRAP y Cathepsin K+ al eliminar las células senescentes usando senolíticos (D + Q) (Figs. 9d, f y S6).

La administración de D + Q redujo significativamente el número de células RANKL+, p21+ y/o p16+, lo que provocó la inhibición de la reabsorción de la raíz (Fig. 9a–f). Se sabe que dasatinib inhibe la expresión de RANKL en las células del estroma de la médula ósea63 y la formación de osteoclastos;64,65 el fármaco podría inhibir directamente la expresión de RANKL de los cementoblastos senescentes y la formación de PDL y odontoclastos de los preodontoclastos. Mientras tanto, estudios previos han demostrado que la estimulación mecánica promueve que las células secreten ROS66 y citoquinas inflamatorias.67 Esos factores paracrinos pueden causar daño en el ADN e inducir la senescencia celular.68 Además, las células del linaje de monocitos-macrófagos expuestas a ROS exógenas activan la cascada de señalización de RANKL, que conducen a la formación de osteoclastos.69 Por el contrario, la quercetina, un componente D + Q, tiene efectos antioxidantes y antiinflamatorios.38 Por lo tanto, el tratamiento con D + Q puede suprimir las células no senescentes para producir sustancias inflamatorias o ROS, lo que puede prevenir la la inducción de células senescentes y la activación de la señalización de RANKL sin causar muerte celular. Sin embargo, administramos D + Q en los días de estrés 1 y 7, y el número total de células CAP+ en los tejidos periapicales también disminuyó en el día de estrés 14 (Fig. 9c); La célula TUNEL+ aumentó en el día 8 (Fig. S4). Por lo tanto, suponemos que D + Q tenía varias funciones: impedir la inducción de la senescencia celular en la fase temprana, causar la muerte celular de las células senescentes RANKL+ e impedir la formación de odontoclastos a partir de los preodontoclastos, lo que evita la reabsorción de la raíz en la fase tardía.

Estudios previos informaron que la estimulación de RANKL causa la expresión de p21 durante la formación de osteoclastos.70 Por lo tanto, no podemos concluir si los odontoclastos experimentan senescencia celular solo a partir de la expresión de p21. Sin embargo, en este estudio, encontramos un número limitado de células multinucleares de catepsina K+p21+p16+ en la fosa de reabsorción de la raíz (Fig. 8), lo que sugiere que los odontoclastos senescentes existen bajo estimulación de estrés mecánico. Aunque actualmente se desconocen las diferencias funcionales entre las células similares a odontoclastos senescentes y otros odontoclastos, algunos casos de reabsorción de la raíz apical no se recuperaron durante 25 años.71 Dadas las características de las células senescentes que evitan la apoptosis, los odontoclastos senescentes pueden sobrevivir a largo plazo y contribuyen a la severidad de la reabsorción radicular.

En este estudio, demostramos que las células senescentes inducidas por estrés mecánico inducidas por OTM contribuyeron a la reabsorción de la raíz. Sin embargo, son indispensables exámenes más detallados para explorar los mecanismos subyacentes a las relaciones entre las células senescentes, la odontoclastogénesis y la reabsorción radicular. Por ejemplo, existe una discrepancia entre el número de células senescentes RANKL+ y odontoclastos durante la reabsorción radicular (otras células, moléculas, etc., pueden contribuir a la formación de odontoclastos). La asociación a largo plazo de las células senescentes con la reabsorción radicular sigue sin estar clara. Además, debemos comparar con cautela los resultados en humanos y ratas. Otras condiciones, como distintos intervalos de administración, duraciones y concentraciones, provocarían resultados diferentes. Es esencial un examen más detallado para verificar qué agentes senolíticos son aplicables para uso clínico para evadir los efectos secundarios. Es importante destacar que, aunque nuestro estudio no pudo dilucidar los mecanismos moleculares detallados entre la expresión de RANKL y la formación de odontoclastos inducida por la senescencia celular bajo estrés mecánico utilizando ensayos in vitro, esos datos reforzarían la asociación de células senescentes con la formación de odontoclastos. Los mecanismos deben dilucidarse en detalle. Sin embargo, hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra que los cementoblastos senescentes inducidos por estrés mecánico o las células PDL desempeñan un papel crucial en los mecanismos de reabsorción de la raíz in vivo; el senolítico representativo utilizado en este estudio evitó la odontoclastogénesis y la reabsorción radicular. Además, se reveló la distribución espaciotemporal de las células senescentes y los odontoclastos en los tejidos periapicales bajo el movimiento dentario ortodóncico. Estos hallazgos pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre el desarrollo de nuevos métodos de prevención y tratamiento para la reabsorción radicular, que ha sido una preocupación duradera para los médicos desde que comenzó el tratamiento de ortodoncia.

En primer lugar, se dobló un alambre de acero inoxidable de 0,014 pulgadas (Ormco Corp. Brea, California, EE. UU.) con unos alicates de alambre ligero, que se muestran en la Fig. 1a, b que ilustran las formas inicial y activada, respectivamente. El diseño se basa en el motivo de bucle en L comúnmente utilizado en el tratamiento de ortodoncia clínica. Los criterios de diseño específicos fueron: (1) los bucles en L se hicieron con un paso vertical de 1 mm entre la línea distal del bucle y la línea mesial del bucle en la forma inicial, y (2) los bucles en L se activaron por empujando la línea distal hacia abajo a la misma altura que la línea mesial. La fuerza vertical durante la activación fue de 5 N. Para confirmar la consistencia del bucle en L, se midió una fuerza de prueba vertical en el estado activado para el bucle en L utilizado en el experimento con un dispositivo de máquina de prueba universal en el departamento de investigación de biomateriales, Osaka Dental Universidad. El mismo experimentador repitió la medición tres veces para obtener una fuerza de prueba promedio de 5 N como modelo OTM.

El comité de ética local de la Universidad Dental de Osaka aprobó los experimentos con animales y se siguieron estrictamente las políticas pertinentes (Número de aprobación: 22-02031). Se utilizaron ratas Sprague Dawley (macho, 15 semanas de edad) que pesaban 400–450 g para el grupo experimental para evitar la generación de células senescentes relacionadas con la edad que afectarían el experimento. Todas las ratas se adquirieron de SHIMIZU Laboratory Supplies (Kyoto, Japón). Los modelos OTM se ajustaron como se muestra en la Fig. 1a, b. Después de la anestesia general con una mezcla de tres agentes anestésicos (tartrato de butorfanol: 2,5 mg·kg-1, midazolam: 2 mg·kg-1, clorhidrato de medetomidina: 0,15 mg·kg-1), se colocó un asa en L en las ratas ' izquierda M1 (Fig. 1b). Los alambres en las superficies oclusales de los segundos y terceros molares fueron empujados hacia abajo verticalmente durante la fijación y se usó resina (Kuraray Noritake, Nigata, Japón) para fijar los alambres en la porción distal de las superficies oclusales M2 y M3. Luego, se activó el bucle en L y se aplicó una fuerza de 5 N a la superficie oclusal de M1. Utilizamos 32 ratas, divididas de la siguiente manera (4 ratas por grupo; Fig. 1c): 1. Grupo sin tratamiento (Control): sacrificadas después de 14 días; 2. Grupos experimentales: sacrificados los días 0, 3, 5, 7 y 14 después de la instalación del bucle en L; 3. Grupos 8d+D+Q y 14d+D+Q: se administraron senolíticos D+Q los días 1 y 7 después de la instalación del bucle en L y se sacrificaron los días 8 o 14.

Para observar la morfología de OTM y la reabsorción radicular, se escanearon muestras de maxilar de rata mediante μ-CT (SkyScan 1275, Bruker Co., Billerica, MA, EE. UU.) con un voltaje de 85 kV, una corriente de 65 μA y una alta resolución. de 1944 × 1546. Los datos 3D se reconstruyeron utilizando el software SkyScan™ CT Analyzer (versión 1.17.7.2) y Mimics (software 13.1 Materialise, Lovaina, Bélgica). Se dibujaron líneas de referencia a lo largo del lado bucal del molar izquierdo de las ratas en las cúspides mesial y distal (Fig. 1d). La distancia vertical desde la cúspide mesial del M1 hasta la línea de referencia se consideró OTM (Fig. 1d). Las mediciones se realizaron utilizando ImageJ (versión: 2.1.0, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU.). También se cuantificó la RMD media del ápice de la raíz mesial del maxilar izquierdo M172.

Las muestras se fijaron en formalina neutra al 10% durante 24 horas. Después de la desmineralización en solución de desmineralización neutra B de ácido etilendiaminotetraacético (es decir, EDTA) (Cat No. LEP2494; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) a 4 °C durante 2 semanas, los dientes se deshidrataron en un gradiente de sacarosa. Las secciones congeladas de todas las muestras se prepararon utilizando el método de Kawamoto.73 Se obtuvieron secciones congeladas en serie de 10 µm de espesor utilizando un criotomo (Leica CM3050S; Leica Biosystems, Richmond, IL, EE. UU.). La tinción con HE de las secciones desmineralizadas se realizó utilizando procedimientos estándar siguiendo un método previamente informado.48 La tinción TRAP se realizó utilizando el kit de tinción (Cat. No. 294-67001; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) para confirmar los odontoclastos y los osteoblastos. Las imágenes se tomaron con un microscopio digital BZ-9000 (Keyence Corporation, Osaka, Japón).

Las secciones descalcificadas se revitalizaron con antígeno con solución de recuperación de antígeno al 10 % HistoVT One (n.º de cat. 06380-76, Nacalai Tesque. Inc. Kyoto, Japón), luego se bloquearon y permeabilizaron en suero de cabra al 5 % y Triton X-100 al 0,3 % en fosfato. -solución salina tamponada, respectivamente. A continuación, las secciones se conjugaron con anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal anti-p21 ALEXA FLUOR® 555 (Cat. No.: bs-10129R-A555, Bioss Antibodies Inc, Woburn, MA, EE. UU., 1:100), anticuerpo policlonal anti-p16 ALEXA FLUOR® 594 (Cat. No.: bs-23881R-A594, 1:100), anticuerpo policlonal anti-p16 ALEXA FLUOR® 488 conjugado (Cat. No.: bs-23881R-A488, 1:100), anti- Conjugado RANKL ALEXA FLUOR® 647 (n.º de cat.: bs-20646R-A647, 1:100), conjugado anti-catepsina K ALEXA FLUOR® 647 (n.º de cat.: SC-48353 AF647, Santa Cruz Biotechnology. Inc, California , EE. UU., 1:100) y proteína de unión anti-cemento (3G9) conjugado ALEXA FLUOR® 488 (n.º de cat.: SC-53947 AF488, 1:100), conjugado anti-Ki67 ALEXA FLUOR® 488 (n.º de cat. .: 118825, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, Massachusetts, EE. UU., 1:100). Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C y se montaron con DAPI-Fluoromount-G®. Luego, se observaron bajo un microscopio confocal láser (LSM-700, Zeiss-Microscopia, Jena, Alemania).

Todos los reactivos de tinción TUNEL anteriores se obtuvieron de los kits de ensayo CF™ Dye TUNEL ALEXA FLUOR® 647 (Cat. No. 30074, Fermont, CA, Biotium, Inc.). Todas las secciones se tiñeron según el protocolo del kit y se montaron con DAPI-Fluoromount-G®. Todas las secciones se observaron bajo un microscopio confocal láser (LSM-700, Zeiss-Microscopia, Jena, Alemania).

Los análisis cuantitativos de TRAP, tinción de TUNEL y tinción de inmunofluorescencia se calcularon de la siguiente manera: la región de interés (ROI) en cada sección se analizó bajo un campo de visión de 10x (tinción de TRAP) o 20x (tinción de TUNEL e inmunofluorescencia). Luego, se seleccionó una capa de células de cemento en la línea de demarcación del borde de la raíz como el ROI de la superficie de la raíz por sección. El rango desde la capa externa de células en la línea de demarcación hasta la superficie del hueso alveolar se tomó como el ROI del área del PDL. Usamos ImageJ (versión: 2.1.0, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU.) para contar la cantidad de células positivas para TRAP dentro del ROI y Fiji2 (versión: 1.0, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU.) EE. UU.) para contar el número de células positivas para TUNEL y positivas para tinción multiplex de inmunofluorescencia dentro del ROI. Probamos cuatro muestras de cuatro ratas (n = 4). Cada rata se sometió a un experimento independiente.

La solución de PEG-200 se preparó disolviendo polietilenglicol 200 (PEG-200, n.° de catálogo: ESL3444, FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Osaka, Japón) en MillQ. Dasatinib (Cat. No.: 11498, Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, EE. UU.) y quercetina (Cat. No.: sc-206089A, SCB Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, EE. UU.) se disolvieron en el solución de PEG-200 preparada anteriormente y mezclada completamente para hacer senolíticos. A cada rata en el grupo post-estrés se le administró por vía oral senolíticos a 6,67 mg·kg-1 (D) y 66,7 mg·kg-1 (Q) en los días 1 y 7 después de la instalación del circuito en L, respectivamente.

Todos los datos se analizaron estadísticamente utilizando Prism 8 (GraphPad Software Co., San Diego, CA, EE. UU.). Todos los resultados se presentaron como medias ± desviaciones estándar. Se utilizó la prueba t de Student para las comparaciones entre dos grupos. Se realizó un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey para las comparaciones entre cinco grupos. Un valor P de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Todos los datos asociados con este estudio se presentan en el documento.

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Agradecemos a Ye Zhang, Yuzhu Sun (Departamento de Biomateriales, Universidad Dental de Osaka), Jianxin Zhao, Yoshitsugu Nakamoto, Yosuke Miyaji, Hiroshi Matoba (Departamento de Ortodoncia, Universidad Dental de Osaka) por asesorar en los experimentos con animales y a Keita Yoshida (Departamento de Anestesiología). , Universidad Dental de Osaka) y Yuya Hirai (Departamento de Biología, Universidad Dental de Osaka) por su apoyo en la tinción de inmunofluorescencia. Este trabajo fue apoyado por JST, CREST Grant Número JPMJCR22L5, Japón.

Departamento de Ortodoncia, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

Yue Zhou, Aki Nishiura, Hidetoshi Morikuni, Wenqi Deng y Naoyuki Matsumoto

Departamento de Física, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

toru tsujibayashi

Departamento de Anestesiología, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

yoshihiro momota

Departamento de Farmacología, Facultad de Odontología de la Universidad de Showa, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawaku, Tokio, Japón

Yuki Azetsu y Masamichi Takami

Departamento de Anatomía Oral, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

yoshitomo honda

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AN, YH y YZ concibieron y diseñaron la investigación. YZ, WD y AN realizaron el experimento. YZ, AN, YA, MT y YH analizaron los datos. YH, YZ y AN escribieron el borrador y el manuscrito. Documento revisado de HM, TT, YM, YA, MT y NM. AN YH supervisó la investigación. Todos los autores aprobaron la versión final del artículo.

Correspondencia a Aki Nishiura o Yoshitomo Honda.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhou, Y., Nishiura, A., Morikuni, H. et al. Células senescentes RANKL+ bajo estrés mecánico: un objetivo terapéutico para la reabsorción radicular ortodóncica usando senolíticos. Int J Oral Sci 15, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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Recibido: 15 Octubre 2022

Revisado: 29 de abril de 2023

Aceptado: 04 mayo 2023

Publicado: 30 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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