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Apr 22, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1775 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

El complejo apical es una colección especializada de maquinaria citoesquelética y secretora en parásitos apicomplejos, que incluyen los patógenos que causan malaria y toxoplasmosis. Su estructura y mecanismo de movimiento son poco conocidos. Usamos crio-FIB-fresado y tomografía crio-electrónica para visualizar la estructura 3D del complejo apical en sus estados protruido y retraído. Los promedios de fibras conoides revelaron su polaridad y disposición inusual de nueve protofilamentos con proteínas asociadas que conectan y probablemente estabilizan las fibras. Ni la estructura de las fibras conoides ni la arquitectura del complejo conoide en forma de espiral cambian durante la protrusión o la retracción. Por lo tanto, el conoide se mueve como un cuerpo rígido y no tiene forma de resorte ni es comprimible, como se sugirió anteriormente. En cambio, los anillos polares apicales (APR), anteriormente considerados rígidos, se dilatan durante la protrusión del conoide. Identificamos filamentos similares a la actina que conectan el conoide y el APR durante la protrusión, lo que sugiere un papel durante los movimientos del conoide. Además, nuestros datos capturan los parásitos en el acto de secreción durante la protrusión del conoide.

Todos los patógenos intracelulares deben lograr la entrada en una nueva célula huésped. Los parásitos apicomplejos utilizan una maquinaria de invasión compuesta por un complejo citoesquelético especializado y orgánulos secretores. En conjunto, este grupo de orgánulos se conoce como complejo apical. Es por esta estructura que se nombra el filo Apicomplexa, que incluye los agentes causantes de la malaria, la toxoplasmosis y la criptosporidiosis. Los parásitos apicomplejos pertenecen al superfilo eucariota Alveolata, al igual que los ciliados y los dinoflagelados (Fig. 1 complementaria). El complejo apical es esencial para la motilidad del parásito y para la entrada y salida de las células huésped. Además, las mutaciones que interrumpen las funciones del complejo apical bloquean el ciclo lítico de Apicomplexan, lo que los hace no infecciosos1,2,3,4.

El citoesqueleto del complejo apical en sí mismo es una estructura de ~250 nm de largo (~25% de la longitud de una E. coli) compuesta por una serie de anillos organizados alrededor de una espiral central de fibras de tubulina especializadas denominada conoide, y dentro de la cual se organizan los orgánulos secretores y preparado para la secreción (Fig. 1a). Mientras que las fibras conoides están compuestas por los mismos dímeros de tubulina que forman los microtúbulos subpeliculares de los parásitos, no forman tubos cerrados5. En cambio, las fibras conoides forman una estructura abierta en forma de "C"5. El complejo conoide es muy dinámico: sobresale y se retrae6 a medida que los parásitos secretan adhesinas y otros factores de motilidad/invasión7,8. Sorprendentemente, el complejo apical parece haber evolucionado a partir de un cilio eucariótico, ya que contiene tubulina y proteínas asociadas al cilio9,10,11,12. Además, el núcleo del complejo apical, incluido el conoide y sus estructuras especializadas de tubulina, se conserva no solo en Apicomplexa13,14 y en organismos de vida libre estrechamente relacionados15, sino también en Alveolata más distantemente relacionados, como los dinoflagelados16,17 (Supplementary Figura 1). Por lo tanto, el complejo apical parece ser una estructura antigua, cuya composición molecular, estructura de alta resolución y comprensión mecánica de sus funciones siguen siendo en gran parte un misterio.

una descripción general de dibujos animados de los componentes del complejo apical coccidio comparando los estados protruidos y retraídos. Este esquema de colores se utilizará en todo el manuscrito. b Corte tomográfico a través de un conoide parcialmente retraído que se crio-FIB fresado en orientación transversal, muestra claramente los SPMT que terminan cerca del anillo AAD y con proyecciones AAD (flechas moradas) intercaladas entre los SPMT vecinos. c Corte tomográfico del extremo apical reconstruido de N. caninum con conoide protruido. Tenga en cuenta la densidad que conecta las dos membranas del complejo de la membrana interna (IMC, puntas de flecha cian). Para otras etiquetas y colores, consulte a continuación. d Segmentación 3D y visualización del complejo apical de un conoide protruido (tomograma diferente de (c)). Etiquetas y colores utilizados en todo el manuscrito a menos que se indique lo contrario: AAD (púrpura), anillo de densidad asociado a APR amorfo y proyecciones; filamentos de tipo actina (magenta en (c)); APR (rojo), anillos polares apicales; Fibra conoide CF (naranja), microtúbulos intraconoidales ICMT (verde claro), complejo de membrana interna IMC (cian), anillos preconoidales PCR (amarillo), membrana plasmática PM (gris), microtúbulos subpeliculares SPMT (verde oscuro). e Corte tomográfico del extremo apical reconstruido de un N. caninum fresado con un conoide retraído, anotado como en (c). f Segmentación 3D y visualización de un conoide retraído (tomograma diferente de (e)) y coloreado como en (d). En vistas longitudinales, una punta apical se orienta hacia la parte superior de las imágenes en todo el manuscrito, a menos que se indique lo contrario. Barras de escala: 100 nm (en b–e).

Las características ultraestructurales comunes del superphylum Alveolata incluyen las estructuras vesiculares soportadas por citoesqueleto que se encuentran justo en la base de la membrana plasmática y se conocen como alvéolos18. En los apicomplejos, estas estructuras se denominan complejo de membrana interna (IMC), que se extiende a lo largo del parásito19,20,21,22. Los parásitos apicomplejos tienen dos conjuntos distintos de orgánulos especializados, llamados micronemas y roptries, a partir de los cuales se secretan factores de invasión y proteínas efectoras (Fig. 1a)23,24,25. Mientras que la secreción de roptría requiere un estrecho contacto con la membrana plasmática de la célula huésped, se cree que los micronemas secretan continuamente mientras los parásitos están fuera de la célula. Aunque estos orgánulos secretores no están ampliamente conservados entre los alveolados, un trabajo reciente ha demostrado que la secreción de las roptrias está mediada por un complejo que se conserva tanto en su estructura como en sus componentes proteicos en ciliados como Tetrahymena y Paramecium26,27.

La tomografía crioelectrónica celular (crio-ET) es una poderosa técnica de imagen que puede revelar detalles estructurales con una resolución molecular, pero el grosor adecuado de las muestras biológicas se limita a unos pocos cientos de nanómetros28. La mayoría de las células eucariotas intactas son más gruesas que esto. Por lo tanto, estudios previos de crio-ET de células eucariotas completas han obtenido imágenes de regiones celulares naturalmente delgadas, como lamelipodia29 y cilios30, o células que se comprimieron debido a la incrustación en una capa delgada de hielo (fuerza de compresión por la tensión superficial del agua)31,32 . Los especímenes más gruesos se pueden hacer lo suficientemente delgados para crio-ET, ya sea mediante cortes congelados e hidratados con un cuchillo, que es propenso a cortar artefactos33, o mediante fresado de haz de iones enfocado crio34.

Hemos aplicado crio-ET a los parásitos coccidios apicomplejos Toxoplasma gondii, posiblemente el parásito más extendido y exitoso en el mundo, y su pariente cercano Neospora caninum. Nuestro estudio utilizó principalmente la molienda con haz de iones crioenfocados (cryo-FIB) de células imperturbadas incrustadas en hielo grueso para comparar el complejo apical coccidiano en sus estados protruido y retraído in situ, sin los artefactos de compresión y deformación que han plagado los estudios de células intactas no molidas. muestras de apicomplexan31,32,35. Nuestras reconstrucciones tomográficas brindan una vista inigualable de la estructura compleja apical. El promedio de subtomogramas de las fibras del conoide nos permitió demostrar claramente que, contrariamente a una hipótesis popular5,35, el conoide no tiene forma de resorte y no se deforma durante los ciclos de protrusión y retracción. También observamos filamentos que se extienden entre el conoide y los anillos polares apicales (APR) a través de los cuales se mueve el conoide, lo que sugiere que la polimerización de la actina, o una proteína similar a la actina, puede desempeñar un papel durante el movimiento del conoide. Nuestros datos también proporcionan una visión sin precedentes de las interacciones entre los orgánulos secretores del parásito y el citoesqueleto complejo apical. Finalmente, pudimos capturar el acto de fusión de micronemas con la membrana plasmática intacta. Juntos, este trabajo proporciona detalles estructurales y mecánicos para la maquinaria de invasión apicompleja, el complejo apical. Debido a que este complejo es esencial para la infección por parásitos apicomplejos, la comprensión de la base molecular de su función podría revelar nuevos objetivos importantes para la intervención terapéutica para algunas de las enfermedades más devastadoras del mundo.

El citoesqueleto coccidiano parece notablemente bien conservado después de la extracción con detergente y la tinción negativa, lo que ha llevado a muchos estudios TEM de la ultraestructura de apicomplexan utilizando este método de preparación1,4,5,36. Primero probamos si la crio-ET de células de Toxoplasma extraídas con detergente y luego congeladas por inmersión nos permitiría obtener una vista 3D precisa, con una resolución mejorada de las estructuras del citoesqueleto, en comparación con la TEM convencional de muestras teñidas negativamente (secas). Aunque la crio-ET de las muestras tratadas con detergente revela ensamblajes del citoesqueleto, como el conoide apical y los microtúbulos subpeliculares con alto contraste (Fig. 2 complementaria), los tomogramas también muestran artefactos de la extracción con detergente, así como distorsiones estructurales (p. ej., aplanamiento; comparar Fig. 2e-h complementaria) que complicó obtener información estructural confiable de estas muestras.

Por lo tanto, para obtener las muestras menos perturbadas y de mayor calidad, sumergimos y congelamos parásitos vivos e intactos en una capa de hielo relativamente gruesa (> 1 μm de espesor; para evitar el aplanamiento de las células por la tensión superficial del agua). Luego usamos el fresado crio-FIB para generar láminas de 150 a 200 nm de espesor de los parásitos vitrificados, pero por lo demás nativos (Fig. 3 complementaria). Para generar estas muestras, utilizamos la cepa NC1 de Neospora caninum, que es un organismo BSL1 estrechamente relacionado con el patógeno humano Toxoplasma gondii (Fig. 1 complementaria). El conoide de los parásitos extracelulares sobresale y se retrae continuamente, con y sin células huésped presentes, pero justo antes de la congelación por inmersión, los parásitos se prepararon en un tampón similar a intracelular37 o se incubaron con ionóforo de calcio 10 μM durante 10 min. por lo que la mayoría de los parásitos tienen conoides, preferiblemente en estado retraído o protruido6, respectivamente, sin bloquear la motilidad de los conoides o funciones celulares como la secreción. Los criotomogramas resultantes revelan detalles estructurales bien conservados del complejo apical nativo de N. caninum, incluidas membranas, ensamblajes de citoesqueleto y orgánulos (Fig. 1 y Película complementaria 1).

Comparamos la arquitectura del complejo apical de N. caninum en dos estados: conoide protruido y retraído. En el estado sobresaliente (Fig. 1c, d y Película complementaria 1), los anillos preconoidales (PCR) son la estructura del citoesqueleto más cercana a la membrana plasmática apical (Fig. 1c, d), seguida por el conoide asociado que consta de 14–15 fibras conoides dispuestas en espiral (Figura complementaria 2g, h). En comparación con el estado conoide protruido, las fibras conoides en el estado retraído están colocadas justo en la base de las APR, y las PCR están ubicadas ligeramente apicales de las estructuras APR (Fig. 1e, f). Basal al conoide que sobresale, el complejo de la membrana interna (IMC) es claramente visible como una estructura plana de doble membrana con densidades asociadas justo debajo de la membrana plasmática del parásito (Fig. 1c, e). En particular, nuestro crio-ET in situ revela varias densidades (no periódicas) que se unen entre las dos membranas del IMC en forma de lámina extendida (puntas de flecha cian en las Figs. 1c, 2c), quizás sirviendo como "espaciadores" que restringen la distancia entre las membranas. El borde apical de la lámina IMC está unido a los anillos polares apicales (APR; Fig. 1c-f). Justo debajo del IMC, alrededor de 22 microtúbulos subpeliculares se extienden basalmente desde los APR (Fig. 1b-e). Aunque los microtúbulos subpeliculares y las proteínas internas de los microtúbulos asociados (MIP) están bien resueltos en nuestros criotomogramas, no nos hemos centrado en ellos aquí, porque se han analizado previamente en detalle35,38.

La microscopía de luz de súper resolución ha sugerido que los componentes del APR se segregan en anillos independientes39, pero estos anillos han sido difíciles de resolver con EM de tinción negativa. En nuestros tomogramas, podemos resolver claramente varias estructuras en forma de anillo cerca del borde apical del IMC: dos APR distintos con diámetros similares, es decir, el anillo A1 (apical) y el anillo A2 más grueso (basal) que pueden consistir en dos subanillos apilados A2a y A2b (Fig. 2a, b y Figs. Complementarias 2d, 4a-c). También observamos un anillo de densidad amorfa (denominado aquí "densidad asociada a APR amorfa" o AAD) que se encuentra entre el IMC y las puntas de los microtúbulos subpeliculares (flechas/estructura moradas en la Fig. 1b-f y las Figs. 2a complementarias). , d, 4a–c). El AAD parece estar conectado a los anillos APR y tiene proyecciones basales (21 nm de ancho y 64 nm de largo) que están intercaladas entre microtúbulos subpeliculares adyacentes (Fig. 1b). Las proyecciones de AAD no se han informado a partir de estudios EM convencionales, pero se han observado recientemente en otro estudio crio-ET (llamados "pilares intercalados" en la referencia 35). Observamos las proyecciones de APR, anillo AAD y AAD en tomogramas de los estados de conoide protruidos y retraídos. Curiosamente, el anillo y las proyecciones de AAD parecen conservados durante la extracción con detergente del parásito (Figs. Complementarias 2a, d, 4a, b). Esta localización y el comportamiento bioquímico sugieren que el anillo y las proyecciones de AAD pueden contener componentes de la tapa apical del IMC, que se han localizado recientemente mediante microscopía óptica de superresolución intercalados entre microtúbulos4,40. Sin embargo, en estos estudios, las proteínas de la tapa apical conocidas, como ISP1 y AC9, se extienden ~1 μm desde el APR, mucho más allá de los ~64 nm ocupados por las proyecciones de AAD. Por lo tanto, el anillo y las proyecciones de AAD parecen estar compuestos por proteínas que aún deben identificarse o localizarse con precisión.

Caricatura del complejo apical en estado protruido, destacando las estructuras APR e IMC. b Un corte tomográfico (orientación longitudinal) muestra dos anillos APR distintos (puntas de flecha rojas) y el anillo AAD (punta de flecha morada), que se encuentra entre APR e IMC. c Un corte tomográfico transversal muestra el IMC cerca del borde apical con densidades "espaciadoras" (puntas de flecha cian) entre las dos membranas. d, e Cortes tomográficos a través del complejo conoide sobresaliente de dos parásitos. Las medidas marcan las distancias mínimas entre el IMC y las fibras del conoide a cada lado del conoide. f, g Corte tomográfico (f: original; f': pseudo-coloreado) y representación de isosuperficie segmentada en 3D (g) de la misma región en la base de un conoide protuberante muestran densidades similares a la actina filamentosa (magenta) que se conectan entre el conoide (naranja) y las TAE (roja). Barras de escala: 100 nm (en b, d, e); 50 nm (en c, f).

Sorprendentemente, y en contraste con la idea de que el APR sirve para anclar fuertemente el conoide a la membrana del parásito, el conoide que sobresale nunca aparece completamente cuadrado con los APR en nuestros tomogramas (compárelo con el protruido en las Figs. 1c, d, 2d, e con el retraído). en la figura 1e, f y la figura complementaria 4d-f). En cambio, el conoide parece capaz de inclinarse y estar descentrado en relación con el APR anular a medida que sobresale. Para cuantificar esta observación, comparamos las distancias entre el borde apical del IMC y el borde basal del conoide desde lados opuestos en cortes centrales a través de nuestros tomogramas (Fig. 2d, e y Fig. 4d-f complementaria). Encontramos que la diferencia entre las distancias opuestas varió más en los tomogramas del estado protruido (Δd = 52 ± 12 nm; n = 3) que en el estado retraído (Δd = 10 ± 4 nm; n = 3). Estos datos eran consistentes con la idea de que el conoide está "atado" a los APR y/o al borde apical del IMC con el AAD por estructuras flexibles y tal vez dinámicas. De hecho, con frecuencia observamos filamentos entre la región APR y las fibras conoides (Figs. 1d, 2f, g y Fig. 4g-l complementaria).

Estudios previos demostraron que la "motilidad de deslizamiento" de apicomplexan está impulsada por el movimiento continuo de las fibras de actina entre el citoesqueleto del IMC y la membrana plasmática del parásito41,42. Recientemente, se utilizaron nanocuerpos de actina F para demostrar que las fibras de actina se nuclean en el conoide y se transmiten al parásito a medida que se mueve3. Observamos claramente filamentos consistentes en diámetro con fibras de actina (~8 nm de diámetro) que se extienden desde el conoide para conectarse con la región APR, cerca de donde se esperaría que ocurriera el traspaso a la red de miosina asociada a IMC41,43. Estos filamentos varían en longitud de 38 a 164 nm en nuestros tomogramas (n = 14 fibras de tres tomogramas), lo que sugiere que son de naturaleza dinámica (Figs. 1d, 2f-g y Fig. complementaria 4g-l).

En contraste con los parásitos intactos, en nuestras muestras extraídas con detergente, la base del conoide parece asentarse directamente sobre los APR (Figuras complementarias 2a, 4a, b), como se ve típicamente en muestras tratadas de manera similar mediante tinción negativa EM4,5,36 . Este colapso de la brecha y las estructuras filamentosas sugiere incorrectamente que el APR y sus conexiones con el conoide son mucho más rígidos de lo que observamos en nuestras muestras molidas con crio-FIB, pero por lo demás imperturbables, lo que nuevamente resalta el valor de nuestro análisis in situ. de las estructuras en sus estados nativos.

Como se describe a continuación, las fibras conoides son polímeros de tubulina inusuales en los que los protofilamentos forman una sección transversal abierta en forma de C (Película complementaria 1). Estas fibras se describieron inicialmente como una herida en una estructura "similar a un resorte"5, lo que llevó a un modelo de que los movimientos conoides eran impulsados ​​por un mecanismo similar a un resorte, que implicaba ciclos de deformación en la estructura conoide seguidos de liberación. Esta hipótesis se hace más atractiva debido a la inusual forma de C de las fibras conoides, que se esperaría que fueran más deformables/compresibles que los microtúbulos cerrados. Antes del desarrollo de la molienda crio-FIB, la microscopía electrónica y el análisis de tomografía del conoide requerían la extracción con detergente de la membrana del parásito y/o el aplanamiento celular, lo que a menudo resulta en artefactos estructurales durante la preparación de la muestra y durante el procesamiento de imágenes, donde el sesgo de orientación impide la adecuada corrección de cuña faltante (Figura complementaria 2a-f, i). Nuestros datos del complejo apical nativo no perturbado nos permiten abordar sin ambigüedades los cambios de la ultraestructura del conoide durante diferentes estados funcionales.

Por lo tanto, buscamos evaluar si los movimientos de los conoides se comportaron de acuerdo con el modelo similar a un resorte que involucra la deformación de las fibras conoides y conoides. Razonamos que cualquier cambio ultraestructural bruto en la conformación del polímero conoide daría como resultado cambios en las dimensiones y arquitecturas generales del conoide. Comparamos las dimensiones de los conoides protruidos y retraídos en tomogramas de N. caninum molida con crio-FIB (Fig. 3 y Fig. 5 complementaria). Ni los diámetros de los conoides apicales (244 ± 19 nm protruidos frente a 236 ± 8 nm retraídos), los diámetros basales (350 ± 25 nm frente a 326 ± 7 nm), ni las alturas de los conoides (277 ± 5 nm frente a 262 ± 13 nm) nm) fueron significativamente diferentes entre los dos estados (Fig. 3e y Fig. 5a complementaria). De manera similar, el ángulo de las fibras conoides en relación con las PCR y los intervalos entre las fibras conoides adyacentes fueron indistinguibles en los dos estados (Fig. 3f-i). Además, tanto la longitud media de la fibra conoide como la distribución de longitudes en la población no fueron significativamente diferentes entre los estados protruidos y retraídos (399 ± 37 nm frente a 405 ± 45 nm; Fig. 6a complementaria).

Los cortes tomográficos a–d' a través del centro del complejo apical muestran el conoide en los estados protruido (a) y retraído (b). Las líneas blancas indican las medidas del diámetro apical (a), el diámetro basal (b) y la altura (h) de la estructura conoide. Los cuadros blancos en (a, b) indican las áreas ampliadas en (c, d) donde interactúan el conoide y el complejo asociado con APR; (c' y d') son las versiones pseudo-coloreadas de (c y d), coloreadas como se detalla en la Fig. 1. Tenga en cuenta la densidad alargada en forma de lámina (puntas de flecha doradas en a y b) que sigue entre micronemas y ICMT dentro el conoide. Las densidades de "espaciador" de IMC se indican con puntas de flecha cian en (a, c). e Las mediciones del diámetro apical, el diámetro basal y la altura de los conoides protruidos (n = 3 tomogramas, barras blancas) y retraídos (n = 3 tomogramas, barras grises) no muestran cambios significativos durante los ciclos de protrusión y retracción. f–i Cortes tomográficos (f, g) a través del borde de los conoides reconstruidos (que muestran las fibras conoides en la sección longitudinal) en los estados protruidos (f) y retraídos (g). Las líneas indican la medida del ángulo relativo entre las CF y el plano PCR (n = 14 medidas para los estados protruidos y 13 medidas para los estados retraídos, líneas rojas) y la medida de la distancia entre las CF vecinas (n = 24 medidas para el saliente y 18 medidas para los estados retraídos, líneas azules); los resultados de las últimas mediciones para conoides salientes y retraídos se muestran en (h) e (i), respectivamente. Los cortes tomográficos j–m muestran PCR (j y m) y APR (k y l) representativos en vistas transversales del complejo apical en estados protruidos (j, k) y retraídos (l, m). Los diámetros de APR y PCR se indican como rangos de todos los tomogramas disponibles (n = 3 para APR en ambos estados; n = 3 PCR sobresalientes; n = 2 PCR retraídos). Barras de escala: 100 nm (en a, b, j–m); 50 nm (en c, d, f, g). Los datos se expresaron como media ± desviación estándar. La significación estadística se calculó mediante una prueba t de Student de dos colas. ns no significativo (p > 0,05).

Mientras que la punta apical del conoide y los PCR están nivelados con el APR cuando el conoide se retrae, después de una extensión del conoide, la base del conoide se ubica en la región del APR (comparar Fig. 3a, c, c ' con 3b, d, d'). Al cambiar entre los estados protruído y retraído, las regiones IMC apicales, la AAD y las APR cambian de posición en relación con el conoide y sus PCR asociadas, y con la membrana plasmática (Fig. 3a-d'). Las posiciones de los APR y AAD aparecen estrechamente acopladas al borde apical del IMC en nuestros tomogramas, que parecen flexionarse apicalmente en el estado protruido. Por lo tanto, preguntamos si los APR exhibieron cambios estructurales correlacionados con la protrusión y retracción del conoide. Medimos los diámetros de los APR en cada uno de nuestros tomogramas y determinamos que hubo un aumento sorprendente del 10 al 30 % en el diámetro del APR en los estados de protrusión versus retracción (Fig. 3k, l y Fig. 5b complementaria). En contraste con los APR, la estructura de los PCR y el conoide no mostraron diferencias observables entre los dos estados (Fig. 3j, m y Fig. 5c complementaria).

A continuación, evaluamos la estructura de la fibra conoide a una resolución más alta mediante la generación de promedios de subtomograma separados de las fibras conoides de los estados sobresalientes (Fig. 4a; resolución de ~ 3,0 nm a 0,5 FSC, consulte la Fig. 6b complementaria) y estados retraídos (Fig. 4b; Resolución de ~ 3,2 nm a 0,5 FSC, consulte la Fig. 6b complementaria). Visualmente, los promedios del subtomograma de las fibras conoides de cualquier estado parecen en gran parte indistinguibles y revelan los nueve protofilamentos de tubulina5, así como distintas densidades de proteínas que decoran las fibras (Fig. 4a, b). Para evaluar mejor cualquier variación entre los dos estados, ajustamos los dímeros de tubulina en los dos mapas crio-ET promediados usando Chimera44 (Fig. 4c, d) con coeficientes de correlación de ~ 0.9. Luego superpusimos los modelos de mejor ajuste de una sola repetición de la fibra conoide de cada estado (Fig. 4e). De acuerdo con la falta de diferencia entre la forma de toda la estructura conoide entre los dos estados (Fig. 3), cada una de las nueve subunidades de protofilamento aparece posicionada indistinguiblemente entre los dos estados dentro de la resolución de los datos y el error de ajuste (Fig. 4e). Tenga en cuenta que las tres subunidades de protofilamento con el RMSD más alto en su superposición (PF5-7; Fig. 6c complementaria) se ajustan en una región de resolución más baja de los promedios.

a, b Cortes tomográficos transversales de las repeticiones promediadas de 8 nm de las fibras CF en los estados protruido (a) y retraído (b). c–e La estructura de alta resolución de la tubulina se ajustó a los promedios de los subtomogramas de los estados sobresaliente (c, azul) y retraído (d, rosa). La comparación (e) de los dos modelos de protofilamento pseudoatómico en los estados saliente (azul) y retraído (rosa) no muestra una diferencia significativa. f Vistas longitudinales del modelo de protofilamento pseudoatómico en el estado retraído. El tono se estimó en función del aumento de los MAP periódicos asociados a CF entre protofilamentos vecinos. g La representación de la isosuperficie de los protofilamentos promediados con pliegues agradables muestra un "sesgo en el sentido de las agujas del reloj" cuando se ve desde la base del conoide, lo que sugiere que los extremos negativos de las fibras del conoide están orientados hacia la base. h Las disposiciones de los protofilamentos modelados en los FC (rosa) en comparación con la estructura crio-EM de alta resolución de los típicos microtúbulos subpeliculares de 13 protofilamentos (verde; EMDB: EMD-23870). La diferencia más sustancial es el cambio de ángulo entre PF4 y PF5, lo que provoca una fuerte torcedura en la disposición de los protofilamentos. i–k Cortes tomográficos de los promedios globales del subtomograma CF que combinan todos los datos de los estados protruido (a) y retraído (b) vistos en corte transversal (i: original; i': pseudo-coloreado) y longitudinal (j y k) orientaciones. Las líneas blancas en (i) indican las ubicaciones de los cortes en los paneles respectivos. Etiquetas y colores ver más abajo. Las representaciones de isosuperficie l–o muestran las estructuras 3D de las repeticiones de CF promediadas en vistas transversales (l) y longitudinales (m), así como las CF de un conoide completo (n) al ensamblar las repeticiones de 8 nm promediadas nuevamente en el tomograma completo. Esto y el acercamiento (o) muestran que la cara abierta de los CF en forma de C mira hacia el interior del conoide. Etiquetas y colorantes: 1–9, protofilamentos; IA (azul) y OA (rosa) densidades del "brazo de la capa interna" y del "brazo de la capa externa", unión interna IJ (amarillo), MAP; MAP1 (naranja), MAP2 (magenta), MAP4 (verde), proteínas asociadas a microtúbulos. Barras de escala: 10 nm (en a, b, i–k).

En conjunto, nuestros datos demuestran que el conoide parece moverse como un cuerpo rígido durante la protrusión y la retracción, en lugar de una estructura conformacionalmente deformable, y no hay una reorganización obvia de los protofilamentos dentro de las fibras del conoide durante este proceso. Sin embargo, a partir de estos datos, no podemos descartar cambios conformacionales menores entre los dos estados. Nuestros datos in situ también corroboran que las fibras conoides forman una disposición inusual en forma de C abierta de nueve protofilamentos5 que requiere contactos distintos de un MT típico de 13 protofilamentos (Fig. 4h).

Habiendo demostrado que las fibras conoides no experimentan cambios conformacionales importantes entre los estados protruidos y retraídos, combinamos partículas de ambos estados para calcular un promedio global de las fibras conoides (Fig. 4i-k). El promedio resultante de los dos estados muestra una relación señal-ruido marcadamente mejorada y una resolución de ~ 2.8 nm en el criterio de 0.5 FSC (o ~ 2.2 nm en el criterio de 0.143 FSC; Fig. 6b complementaria) y revela recubrimiento de densidad tanto los bordes externos (proteínas asociadas a MT; MAP) e internos (proteínas internas de MT; MIP) de la fibra conoide (Fig. 4i-o y Película complementaria 1). Las densidades de MIP unen múltiples protofilamentos y cubren casi toda la superficie interna de la fibra conoide (Fig. 4i, i'). Estos contactos pueden ayudar a explicar la aparente rigidez de la estructura de fibra conoide. La superficie externa de las fibras conoides también aparece casi completamente decorada con MAP (Fig. 4i-o y Fig. 2i-k complementaria). Asociadas con PF5-8 hay dos capas de MAP, denominadas aquí densidades de "brazo de capa interna" y "brazo de capa externa" (IA y OA; Fig. 4i, j y Fig. 2i, j complementaria). Los MAP adicionales incluyen MAP1, 2 y 4 que están asociados con PF1, 2 y 4, respectivamente. También observamos densidades MAP de unión interna (IJ) que conectan PF3 de una fibra conoide (n) con PF9 de la fibra vecina (n + 1; Fig. 4i, i', k–o y Figs. complementarias 2i, i' , k, 6f-h). Estos contactos entre fibras probablemente estabilizan la estructura conoide espiral y refuerzan su rigidez. La mayoría de los MAP exhiben una periodicidad clara de 8 nm a lo largo de la fibra conoide (Fig. 4j, k, m y Figs. Complementarias 2j, k, 6e, e ').

Los microtúbulos regulares son ensamblajes helicoidales que tienen una característica lateralidad, paso helicoidal y polaridad. Por ejemplo, un microtúbulo típico de 13 protofilamentos forma un polímero recto con un aumento de tres monómeros (12 nm) por vuelta helicoidal hacia la izquierda (una "hélice 13-3"), o un aumento de 0,92 nm por contacto de protofilamento a protofilamento45 . Usando los MAP espaciados regularmente como guía, pudimos asignar el paso de la fibra conoide en vistas longitudinales (Fig. 4f, j, k y Figs. Complementarias 2j, 6e, e '). Como las fibras conoides en forma de C se forman a partir de un microtúbulo helicoidal abierto, en lugar de cerrado, calculamos solo el paso de protofilamento a protofilamento. Nuestro modelo indica que la fibra conoide se forma a través de un ensamblaje zurdo, como un microtúbulo típico, pero tiene un paso estimado de ~1,5 nm de protofilamento a protofilamento, que es ~1,6 veces más grande que un microtúbulo típico (Fig. 4f y la figura complementaria 6e, e'). Para determinar la polaridad estructural de la fibra conoide, realizamos un promedio de nueve veces de los protofilamentos (usando la tangencial/normal a la curvatura en forma de C de la fibra). La representación de la isosuperficie de los protofilamentos con un promedio de nueve veces mostró un "sesgo en el sentido de las agujas del reloj" cuando se vio desde la base del conoide, lo que sugiere que los extremos negativos de las fibras del conoide están ubicados en la base del complejo del conoide (Fig. 4g).

En lugar de las dos PCR5,9 informadas anteriormente, resolvemos tres PCR (Fig. 5 y Figs. 2b, 7 complementarias): P1 es el anillo más apical y más pequeño (Fig. 5b–d, g, h y Fig. 7e complementaria , i) con un diámetro de 151 ± 6 nm, que probablemente se pasó por alto en muestras anteriores tratadas con detergente y teñidas negativamente; P2 (centro; Fig. 5b-h y Fig. 7f, j complementarias) consta de dos subanillos con los siguientes diámetros: P2a: 178 ± 2 nm, P2b: 217 ± 8 nm; y P3 (basal; Fig. 5c, d, g, h y Fig. 7g, k complementaria) tiene un diámetro de 258 ± 8 nm (Fig. 5b-h). Todos los diámetros se midieron en los bordes exteriores de los anillos en 4 celdas diferentes (n = 4). El promedio de subtomogramas de la PCR de cuatro células de N. caninum reconstruidas produjo un promedio de resolución de 4,9 nm (criterio FSC de 0,5, figura complementaria 6b) y reveló tanto la periodicidad como las conexiones entre las capas de la PCR. En nuestros tomogramas, cada una de las capas parece tener la misma periodicidad, con 45 a 47 subunidades por anillo (Fig. 5g, h). P2 y P3 están conectados con enlazadores espaciados regularmente que tienen una longitud de ~ 25 nm, con una aparente densidad de puente entre las subunidades enlazadoras vecinas (Fig. 5b-d, g y Figs. 2b, 7c complementarias).

una caricatura del complejo apical que destaca la ubicación de los PCR. b–d Cortes tomográficos (b y c) y representación de isosuperficie de las repeticiones de PCR promediadas (d) vistas en las orientaciones tangencial (b) y longitudinal (c y d), que muestran diferentes componentes de la PCR, incluido el P1 apical (resaltado por puntas de flecha azules), P2a (cian), P2b (verde), P3 (amarillo) y el enlazador (naranja) entre P2b y P3. La línea blanca en (c) indica la ubicación del corte en (b). e, f Los cortes transversales de un tomograma sin procesar (e) y las repeticiones de PCR promediadas (f) muestran que el anillo PCR P2 redondo está compuesto por un anillo externo y uno interno, P2a y P2b, respectivamente. El cuadrado amarillo en (e) indica la orientación y ubicación del promedio del subtomograma que se muestra en (f). g, h Las representaciones de isosuperficie muestran las PCR completas ensamblando las repeticiones promediadas en el tomograma completo. Barras de escala, 20 nm (en b, c, f); 50 nm (en e).

La EM convencional de parásitos apicomplejos fijados químicamente e incrustados en resina ha brindado una descripción básica de la organización de los orgánulos secretores apicales dentro del conoide coccidiano5,46, que usamos para guiar nuestro análisis de la estructura in situ del complejo apical, que incluye los orgánulos secretores, en nuestros tomogramas (Figs. 6, 7, Fig. 8 complementaria y Película complementaria 1). Observamos claramente el par central de microtúbulos intraconoidales (ICMT), que se extiende desde la punta del conoide basalmente durante 500–800 nm (Fig. 6a, b y Fig. 6i complementaria), que es más largo que los 350 nm informados anteriormente5. Se ha propuesto que el ICMT es un importante centro organizador de la secreción en los coccidios47,48, y parece tener un conjunto de proteínas asociadas que son distintas tanto de los microtúbulos subpeliculares como de las fibras conoides5, aunque hasta la fecha solo se ha identificado una proteína de este tipo49.

a, b Los cortes tomográficos muestran la punta apical de una célula de N. caninum con los orgánulos secretores organizados alrededor del ICMT (verde) dentro del complejo conoide protruido en vistas longitudinales (a, a': original protruido y pseudocoloreado; b: retraído ). Los ICMT largos conectan el vértice del conoide con el citosol y están estrechamente co-localizados con las vesículas secretoras (azul claro) y dos roptrias (rosa). Tenga en cuenta que la vesícula más apical asociada a la membrana no es visible en el corte tomográfico que se muestra en (a), pero es visible en los paneles (c, d) y la Fig. 7b. Otros colores: CF (naranja), micronemas (azul oscuro), densidad en forma de lámina (dorado), conexiones intervesiculares (rosa), densidad de "coronación" que cubre el extremo negativo apical del ICMT (púrpura). c–e Segmentación 3D y visualización de tomogramas que se muestran en (a y b, respectivamente), es decir, con conoide protruido (c, d) y retraído (e), que muestra la organización general de los orgánulos secretores dentro del complejo conoide, incluidas las FC ( recortado desde el frente para mostrar el contenido del interior), micronemas, roptrias, ICMT, vesículas, conexiones intervesiculares, estructura en forma de lámina a lo largo de los micronemas y membrana plasmática (gris). d muestra un acercamiento desde (c), con fibras conoides ocultas para mayor claridad. f, g Cortes transversales a través de los conoides sobresalientes (f, f'—originales y pseudocoloreados) y retraídos (g) de los tomogramas que se muestran en (a y b). Barras de escala: 100 nm (en a, b); 50 nm (en f, g).

Los cortes tomográficos a–c' (a–c: original; a'–c': pseudocoloreados) muestran: (a, a') cinco vesículas espaciadas regularmente (azul claro), de las cuales cuatro siguen uno de los microtúbulos del ICMT (verde claro) y están conectados por conectores intervesiculares (rosa); (b, b') una roptría (rosa) que interactúa con la membrana plasmática (PM) a través de la vesícula más apical (azul claro) y el complejo de acoplamiento de "roseta" (amarillo); y (c, c') un andamio en espiral (rosa oscuro) asociado con la membrana de la roptria en la región del cuello de la roptria. d, e Rebanadas del subtomograma promediaron repeticiones de 8 nm de los ICMT vistos en orientaciones transversales (d) y longitudinales (e). f Ocasionalmente, se observaron más de dos microtúbulos en el complejo ICMT. Aquí se muestra un ejemplo de tres microtúbulos (puntas de flecha blancas). g ICMT promedio rotacional de trece veces de 53 subtomogramas de células de Toxoplasma extraídas con detergente. Las flechas indican el sesgo en el sentido de las agujas del reloj de los protofilamentos cuando los ICMT se ven de apical a basal, lo que indica que los extremos negativos de los ICMT están orientados apicalmente en el parásito. h, h' Los extremos basales de los ICMT mostraron extremos acampanados y diferentes longitudes de protofilamentos, lo que generalmente se asocia con extremos positivos dinámicos de MT. i Un corte tomográfico de un conoide protruido muestra la organización de los micronemas. Inserto: el subtomograma promedio de puntas apicales de 25 micronemas muestra una tapa aplanada, densa en electrones. j, k Los cortes tomográficos proporcionan una vista transversal lateral (j) y superior (k) de dos orgánulos secretores, un micronema (M) y una vesícula asociada a roptría (V), que se acoplan uno al lado del otro para la membrana plasmática (la vesícula a través de la roseta (Ro)), pero con distintos sitios de acoplamiento (a 44 nm de distancia). Tenga en cuenta que ambos orgánulos están atados (flechas rosadas y azules) a la misma cresta anclada a la membrana plasmática (flechas amarillas). La línea blanca en (j) indica la ubicación del corte en (k). Barras de escala: 100 nm (en I); 50 nm (en a–c, f, h, j, k); 20 nm (en el inserto i), 10 nm (en d, e, g).

En línea con lo que se ha observado con EM de muestras incrustadas en resina5, observamos que distintos orgánulos secretores (las roptrias y los micronemas) se segregan a lados opuestos del ICMT en tomogramas de conoides tanto protruidos como retraídos (Fig. 6). También observamos de cuatro a seis vesículas espaciadas regularmente a lo largo de uno de los microtúbulos del ICMT (Figs. 6a–e, 7a, a'), de acuerdo con informes anteriores26,46. Observamos una sola vesícula justo apical del ICMT que parece acoplarse a la densidad de la "roseta" descrita recientemente (Fig. 7b-b '), y que se ha asociado con facilitar la secreción de roptría26. De acuerdo con esta función, observamos que la vesícula acoplada a la membrana más apical se conecta a las puntas apicales de uno o dos roptries (Fig. 7b, b 'y Fig. 8a complementaria). También identificamos densidades claras que conectan las vesículas tanto con el ICMT como entre sí dentro de una cadena (Figs. 6a-e, 7a). En particular, no observamos esta densidad de puente en la vesícula apical acoplada a la membrana (Fig. 7a; n = 6 tomogramas con la cadena de vesículas y la vesícula apical presentes; tenga en cuenta que en otros tomogramas, la vesícula apical fue fresada por crio- MENTIRA). Mientras que la vesícula apical probablemente se originó a partir de la cadena de vesículas asociada a ICMT, al acoplarse con la membrana plasmática y roptria, parece haberse liberado de la cadena de vesículas y sus conexiones. También observamos que algunas de las vesículas aparecen alargadas a lo largo del eje de la ICMT, lo que sugiere que están bajo tensión y han sido capturadas en tráfico activo a lo largo de la ICMT (Fig. 6a).

Una célula de parásito tiene ~10 roptries y decenas de micronemas, aunque solo un subconjunto de cualquiera de los orgánulos está acoplado al conoide del parásito en un momento dado46. En todos los tomogramas que contenían el diámetro completo del conoide del parásito (6 de 9 tomogramas), observamos dos roptries siguiendo a lo largo del ICMT, pero en lados opuestos del ICMT (Fig. 6c-g; rosa coloreada). Sin embargo, no observamos enlazadores claros que conecten los roptries al ICMT. Dentro de la región apical del parásito, un sacacorchos de densidad en forma de espiral se extiende a lo largo de las membranas de roptry (Fig. 7b-c'), que recuerda el patrón de localización de Ferlin-2 visto por inmuno-EM50. Se estimó previamente que los filamentos que subían en espiral por las roptrias dentro del conoide tenían un diámetro de ~33 nm y un paso de ~21,5 nm a partir de tomogramas de muestras sin moler en las que los parásitos se habían aplanado debido a la tensión superficial51. Descubrimos que tal hélice predicha es consistente con nuestras mediciones de ~ 36 nm de diámetro y ~ 17 nm de paso de parásitos molidos con crio-FIB (Fig. 7c, c ').

Debido a su corta longitud y la variación potencial en sus proteínas asociadas a lo largo de su longitud, el promedio de subtomogramas del ICMT no produjo una resolución suficiente para resolver claramente los MAP o MIP (Fig. 7d, e). En cambio, examinamos la quiralidad de la sección transversal ICMT52 utilizando un promedio de subtomograma ICMT de un tomograma extraído con detergente (Fig. 7g). Este análisis demuestra que ambos ICMT emparejados, a diferencia de las fibras conoides, tienen sus extremos negativos orientados apicalmente. Además, el extremo positivo basal del par ICMT exhibe la morfología extendida típica de un microtúbulo dinámico (Fig. 7h). Esta observación sugiere que el ICMT, a diferencia de la mayoría de las otras estructuras de MT apicomplejas, exhibe inestabilidad dinámica en su extremo positivo (Fig. 7h), y puede explicar por qué las longitudes de ICMT informadas anteriormente varían en gran medida entre muestras y son consistentemente más cortas en muestras extraídas5 versus aquellas que medimos a partir de parásitos nativos intactos. También observamos una densidad que cubre el extremo negativo apical del ICMT (Fig. 6a, b), lo que sería consistente con un centro organizador de microtúbulos desde el cual se polimerizan los ICMT. Sin embargo, en los coccidios, la γ-tubulina parece estar restringida a los centríolos y al citoplasma del parásito, y no se ha localizado en el complejo apical53. Como se informó anteriormente46, algunos ICMT contenían un tercer microtúbulo (Fig. 7f), lo que sugiere que el control riguroso de la estructura es innecesario para su función.

En particular, el ICMT y sus vesículas y roptrios asociados se segregan a un lado del conoide que es distinto de la región ocupada por los micronemas (Fig. 6c-g); por lo tanto, los ICMT no están directamente involucrados en la organización de micronemas para la secreción. Sin embargo, los micronemas no parecen desorganizados (Figs. 6c-e; 7i). En cambio, están dispuestos en grupos y muestran una orientación polarizada distinta. Los micronemas son relativamente uniformes en longitud (220 ± 30 nm) y ancho (58 ± 11 nm; Fig. 8b-h complementaria), y los extremos basales son redondeados, mientras que los extremos apicales parecen estrechos con una tapa aplanada y densa en electrones. (Fig. 7i; recuadro). Esta densidad sugiere un complejo de andamiaje no descrito que proponemos organiza los micronemas y ayuda en su tráfico. Además, en un tomograma de un conoide retraído, observamos dos micronemas que parecen estar acoplados a través de sus puntas apicales con la membrana plasmática (Fig. 8i complementaria). Además, identificamos constantemente una densidad similar a una hoja larga entre los micronemas y el ICMT en nuestros tomogramas (Fig. 6a, b y Película complementaria 1). La hoja varía en grosor entre aproximadamente 4 y 8 nm, parece fibrosa, tiene aproximadamente 15 a 30 nm de ancho y, a menudo, se puede rastrear que se extiende desde la parte superior del conoide hasta debajo de su base. Estos datos sugieren que la estructura en forma de hoja puede ayudar en la organización y el tráfico de orgánulos secretores.

Mientras que los micronemas se secretan continuamente para promover la motilidad de los parásitos extracelulares, también están íntimamente involucrados en desencadenar la invasión de la célula huésped. Para iniciar una invasión de una célula huésped, todos los parásitos apicomplejos dependen de la secreción de un par receptor/co-receptor que comprende una proteína micronema (AMA1) y una proteína roptria (RON2)54,55. Se ha propuesto que los componentes de micronema y roptría del aparato de invasión se mezclen a medida que se secretan a través de un camino común en el conoide23. El hecho de que observemos micronemas segregados de los roptries acoplados cuestiona este modelo. Además, en una tomografía de un conoide sobresaliente, identificamos un micronema que parece haber sido capturado en el proceso de acoplamiento/secreción de la membrana plasmática (Fig. 7j, k y Fig. 8j-m complementaria). De acuerdo con un evento de secreción en curso, el micronema en cuestión tiene aproximadamente la mitad de la longitud de todos los demás micronemas medidos (Fig. 8h complementaria, puntos de datos rojos). Observamos una densidad consistente con un sitio de contacto grande o múltiple en una región circular de ~ 85 nm de diámetro (Fig. 7k y Fig. 8j complementaria, l). También observamos un bolo aparente de densidad en la superficie de la membrana plasmática asociada con el sitio de contacto (Fig. 7j y Fig. 8j complementaria, m), consistente con la secreción de contenido de micronemas. En particular, el sitio de acoplamiento de este micronema secretor está a 44 nm de la roseta y su vesícula apical / rhoptry acoplada, lo que indica que los dos orgánulos secretan en sitios separados utilizando maquinarias secretoras distintas (Fig. 7j). Sin embargo, tanto la vesícula asociada a rhoptry como el micronema acoplado están atados a la misma cresta (Fig. 7j, k y Fig. 8j complementaria; flechas amarillas) y ancla de membrana (Fig. 8m complementaria y recuadro; puntas de flecha amarillas), que probablemente facilitaría la coordinación espacial y temporal de la secreción.

La estructura conoide del complejo apical ha capturado la imaginación de los microscopistas desde sus primeras descripciones por TEM convencional56,57. Aquí, hemos aplicado crio-ET a parásitos crio-FIB-molidos para comparar las estructuras nativas in situ del citoesqueleto del complejo apical coccidiano y los orgánulos secretores asociados en los estados protruidos y retraídos del conoide. Una protuberancia conoide se asocia con cambios morfológicos sorprendentes en la punta apical del parásito que son visibles al microscopio óptico6,58. Estos cambios morfológicos, junto con la forma espiral inusual del conoide, han llevado a un modelo que el conoide tiene forma de resorte y se deforma durante sus movimientos (protrusión/retracción). La crio-EM anterior de parásitos extraídos con detergente59 y un análisis crio-ET publicado recientemente35 documentan las diferencias en los conoides protruidos frente a los retraídos. Sin embargo, el promedio de subtomogramas en Sun et al. El estudio se centró en muestras extraídas con detergente, y las muestras utilizadas en los dos análisis anteriores se comprimieron, lo que puede dar lugar a artefactos estructurales.

Por el contrario, nuestras muestras molidas con crio-FIB conservan la circularidad de la estructura del complejo apical coccidiano (Fig. 2g, h complementarias y Película complementaria 1), lo que permite una interrogación más confiable de su estructura nativa. Nuestros datos muestran que tanto la ultraestructura como la organización molecular de los estados de protrusión y retracción del conoide son indistinguibles, lo que indica que las fibras del conoide no se deforman como un resorte durante los movimientos del conoide y, por lo tanto, no proporcionan energía para ayudar en el movimiento del conoide o en el movimiento. secreción.

Mientras que no observamos cambios en la estructura del conoide retraído frente al protruido, encontramos que el APR parece dilatarse durante la protrusión, lo que parece acoplarse con la flexión del IMC en la punta apical durante la protrusión. Tampoco observamos contactos cercanos entre el conoide y el APR, sino que el conoide que sobresale aparece a menudo algo inclinado en relación con el plano del APR, en consonancia con las ataduras flexibles y/o dinámicas que conectan el conoide con el APR y/o el borde apical del IMC. RNG2 parece ser una de esas proteínas, ya que sus terminales N y C parecen extenderse entre el conoide y APR durante la protrusión60. Mientras que no esperaríamos identificar la densidad de una proteína tan intrínsecamente desordenada, observamos densidades que se extienden entre la base del conoide sobresaliente y el APR que eran consistentes con actina/filamentos similares a actina. Por lo tanto, es posible que la polimerización de actina en este sitio sea al menos parcialmente responsable de generar la fuerza del movimiento conoide. En particular, una descripción temprana de la protrusión de conoides encontró que la despolimerización de actina con citocalasina D atenuaba, pero no anulaba por completo, la protrusión de conoides6. Recientemente, se ha demostrado que la Formina-1, que es responsable de la polimerización de la actina en el conoide, es esencial para la protrusión del conoide61. Sin embargo, se requerirán más estudios estructurales de alta resolución que utilicen perturbaciones genéticas para colocar proteínas individuales en el complejo apical y separar la base física de la dinámica y la función del conoide.

Debido a que nuestras muestras molidas con crio-FIB conservaron las membranas del parásito, obtuvimos una vista incomparable de las interacciones entre el citoesqueleto del complejo apical y los orgánulos secretores especializados del parásito. Observamos contactos estrechos entre el ICMT y tanto las roptrias del parásito como la cadena de vesícula apical. Esto sugiere que los ICMT son los encargados de organizar estos orgánulos, pero no los micronemas, con los que no observamos contactos directos. Curiosamente, mientras que los ICMT no están ampliamente conservados en Apicomplexa fuera de Eucoccidiorida, se ha informado un par de ICMT en Chromera velia15, un alveolado de vida libre que se encuentra entre los organismos existentes más estrechamente relacionados con Apicomplexa (Figura complementaria 1). Por lo tanto, los ICMT probablemente estaban presentes en las especies ancestrales. El hecho de que las vesículas apicales y las roptrias se desplacen a lo largo de la ICMT sugiere que un motor de microtúbulos puede estar facilitando su organización, aunque las cinesinas y dineínas del parásito no se han localizado en la ICMT. Debido a que la mayoría del tráfico de Apicomplexa parece ocurrir en los filamentos de actina3,62,63,64, los motores de los microtúbulos del parásito aún no se han caracterizado sistemáticamente. En particular, hasta la fecha solo se ha identificado una sola proteína localizada en ICMT49, que carece de una homología clara con las estructuras conocidas.

Una importante pregunta abierta en el campo es la base molecular de la fuerza que impulsa la secreción de los orgánulos asociados a la invasión acoplados en el complejo apical. Las roptrias miden >1 μm de longitud y probablemente requieran una maquinaria más compleja que el simple acoplamiento de membrana para impulsar la secreción. Curiosamente, la despolimerización de la actina con citocalasina D bloquea la motilidad y la invasión del parásito, pero no la unión de la célula huésped ni la secreción de roptri65, lo que sugiere que la actina no es responsable de impulsar la secreción. Trabajos recientes identificaron las proteínas Nd apicomplejas que comprenden las "rosetas apicales", estructuras mejor caracterizadas en el grupo ciliado de Alveolata27. Similar a su papel en los ciliados, las proteínas Nd de apicomplexan son esenciales para la secreción de roptry26, y la estructura de roseta se describió recientemente utilizando crio-ET de parásitos sin moler51. La proteína Ferlin-2 de Toxoplasma también se requiere para la secreción de roptri50, y nosotros y otros51 identificamos una densidad en espiral alrededor de las roptrias dentro del conoide que recuerda al patrón de tinción inmuno-EM publicado de Ferlin-250. Estos filamentos en espiral pueden actuar como dinamina para exprimir las roptrias durante la secreción. Entre las proteínas asociadas a Nd de Toxoplasma se encontraban proteínas relacionadas con GTPasa putativas26, lo que sugiere que también puede estar presente una actividad similar a la dinamina en este sitio.

Con la capacidad de congelar rápidamente y, por lo tanto, capturar instantáneas de procesos celulares altamente dinámicos, pudimos observar un micronema acoplado que parece estar en proceso de secreción. Descubrimos que el sitio de secreción de micronemas es distinto del de una vesícula asociada a rhoptry acoplada, lo que sugiere que los componentes de la maquinaria de invasión secretada por estos dos orgánulos deben encontrarse en la membrana plasmática apical después de la secreción. Nuestros datos indican que la secreción de micronemas puede ocurrir durante la protrusión de conoides, eventos que han sido indirectamente correlacionados por otros estudios7. Tenga en cuenta, sin embargo, que estos datos no descartan una secreción adicional durante el estado retraído. Finalmente, no solo observamos una cresta asociada a la membrana plasmática y un ancla entre el micronema acoplado y la vesícula asociada a la roptría, sino también una lámina alargada (fibrosa) que se desplaza entre los micronemas y el ICMT. Estas estructuras pueden representar elementos del citoesqueleto responsables de la organización, el tráfico y el acoplamiento coordinado de membrana de los orgánulos secretores apicales. El recambio de micronemas requiere el tráfico junto con la actina, aunque la biogénesis y la organización de los micronemas parecen ser independientes de la actina63. Se requerirán más estudios para identificar los componentes moleculares del ancla, la cresta y la lámina, y sus funciones en el tráfico y la secreción de orgánulos.

En resumen, la crio-TE de parásitos molidos con crio-FIB nos ha permitido examinar el complejo apical in situ, superando los artefactos de compresión que se producen cuando se preparan células intactas en una fina capa de hielo. Estos avances significativos nos permitieron interrogar la estructura nativa del complejo conoide y sus movimientos durante la retracción y protrusión. Pudimos demostrar sin ambigüedades que el conoide se mueve como un cuerpo rígido durante la protrusión, con proyecciones filamentosas similares a la actina que lo conectan con el APR. La siguiente frontera en la comprensión de la mecánica del complejo apical será la captura de parásitos durante la invasión de la célula huésped. Es posible que los componentes del complejo apical experimenten algún cambio conformacional cuando el parásito está en contacto íntimo con la membrana de una célula huésped. También anticipamos que estudios adicionales que combinen datos proteómicos con crio-ET de parásitos molidos con crio-FIB permitirán la colocación de proteínas individuales en la estructura compleja apical, lo que arrojará nueva luz sobre la base molecular y estructural de sus movimientos y funciones.

El árbol filogenético en la figura complementaria 1 se estimó en RAxMLv8.266 usando el modelo de sustitución LG con heterogeneidad de tasa gamma y frecuencias empíricas con 1000 bootstrap usando una alineación de las secuencias de proteínas para HSP90 concatenadas con RPS11 (accesos: AFC36923.1, BESB_021480, XP_029219085.1, LOC34617734, XP_022591029.1, ETH2_0701200, ETH2_0910900, NCLIV_040880, XP_003884203.1, TGME49_288380, XP_002366350.1, SN3_030 00005, SN3_01300510, PBANKA_0805700, XP_034421046.1, PF3D7_0708400, XP_001351246.1, PVP01_0108700, PVP01_0822500, GNI_014030, XP_011128490. C vel_482, AAA30132.1, XP_764864.1, XP_952473.1, XP_952423. 1, XP_001611554.1, XP_001609980.1, XP_002775585.1, XP_002766754.1, XP_001447795.1, XP_001445466.1, XP_001009780.1, XP_001030186.1, AAR27544 .1, XP_009040431.1, XP_009033899.1).

Se cultivaron fibroblastos de prepucio humano (HFF; un obsequio de John Boothroyd) en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10% y glutamina 2 mM. Los taquizoítos de Toxoplasma gondii (cepa RH) y Neospora caninum (cepa NC1) se mantuvieron en monocapas confluentes de HFF. Las células de Toxoplasma extraídas con detergente y los promedios de subtomograma asociados se muestran en la Fig. 7g y las Figs complementarias. 2a–f, i–k, 4a, b, 6i. En las Figs. 1–6, 7a–f, h–k y figuras complementarias. 2g, h, 3, 4c–l, 5, 6a–h, 7, 8. Para la preparación de parásitos para crio-ET, las monocapas de HFF altamente infectadas se rompieron mecánicamente pasándolas a través de una aguja de calibre 27 para liberar los parásitos. Para las muestras de "conoides retraídos", los parásitos se mantuvieron en "Endo Buffer" (44,7 mM K2SO4, 10 mM MgSO4, 106 mM sacarosa, 5 mM glucosa, 20 mM Tris-H2SO4, 3,5 mg/mL BSA, pH a 8,2 con H2SO4) , que conserva los parásitos en un estado de tipo intracelular37. Para las muestras de "conoides sobresalientes", los parásitos se mantuvieron en solución salina tamponada con HEPES pH 7,4 después de la liberación de las células. Todos los parásitos se pasaron a través de un filtro de 5 μm para eliminar los restos celulares, se lavaron en un tampón apropiado y se recolectaron por centrifugación durante 10 min a 300 × g. Los parásitos se resuspendieron en el tampón respectivo y se incubaron durante 10 min a 37 °C con vehículo (retraído) o ionóforo de calcio 10 μM (protruido; A23187; Cayman Chemicals). Aproximadamente 4 μl de los parásitos extracelulares se pipetearon en una rejilla de carbón perforado R2 / 2 de cobre descargada con brillo (30 s a -30 mA) (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Alemania). Las muestras se secaron con un papel de filtro Whatman (grado 1) durante 3-4 s para eliminar el exceso de líquido, luego la rejilla se sumergió rápidamente en etano líquido utilizando un congelador de inmersión casero. Para las muestras extraídas con detergente, las membranas se extrajeron mediante la adición de Triton-X-100 en HBSS durante 3 a 4 minutos antes de lavarlas brevemente en HBSS y realizar una transferencia inversa, como se indicó anteriormente. Las rejillas vitrificadas se montaron en Autogrids con muescas para molienda crio-FIB (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso.

Las rejillas automáticas con células vitrificadas de N. caninum se cargaron en un transbordador criogénico y se transfirieron a un instrumento de doble haz Aquilos (FIB/SEM; Thermo Fisher Scientific) equipado con una etapa criogénica preenfriada a menos 185 °C. Las imágenes del conjunto de mosaicos de la cuadrícula se generaron en modo SEM, y las células adecuadas para el fresado crio-FIB se seleccionaron utilizando el software Maps (Thermo Fisher Scientific). Para proteger la muestra y mejorar la conductividad, la superficie de la muestra se recubrió con platino durante 20 s a menos 30 mA de corriente y luego se recubrió con una capa de platino organometálico utilizando el sistema de inyección de gas precalentado a 27 °C durante 5 s a una distancia de 1 mm antes de la molienda67, 68. La molienda a granel se realizó con un haz de iones de galio de 30 kV de 50 pA perpendicular a la rejilla en dos lados de una celda objetivo. Luego, la platina se inclinó a 10°-18° entre la rejilla EM y el haz de iones de galio para el fresado de láminas. Para el desbaste, la celda se molió con haces de iones de galio de 30 kV de corriente de 30 pA, seguido de 10 pA para pulir hasta que la lámina final tuviera un grosor de 150 a 200 nm. El proceso de molienda fue monitoreado por imágenes SEM a 3 keV y 25 pA. Se trituraron un total de 178 láminas de N. caninum en varias sesiones.

Se obtuvieron imágenes de laminillas molidas con crio-FIB de las regiones apicales vitrificadas de los parásitos usando un microscopio electrónico de transmisión Titan Krios de 300 keV (Thermo Fisher Scientific) equipado con un filtro de energía post-columna Bioquantum (Gatan, Pleasanton, CA) usado en cero pérdida. modo con un ancho de rendija de 20 eV y una placa de fase de Volta con un desenfoque de -0,5 μm69. Se utilizó el software de control del microscopio SerialEM v4.0.8 para operar el Krios y recolectar series de inclinación de 56° a −56° en incrementos de 2° usando un esquema de inclinación simétrico de dosis en el modo de dosis baja70,71. Las imágenes se capturaron con una cámara de detección de electrones directos K3 de 5k × 6k (Gatan) con un aumento de 26.000x (tamaño de píxel de 3,15 Å). Se usó el modo de conteo de la cámara K3, y para cada imagen inclinada, 15 fotogramas (0,04 s de tiempo de exposición por fotograma, la tasa de dosis de ~28 e/píxel/s; los fotogramas se grabaron en modo de superresolución y luego se agruparon por 2) fueron capturados. La dosis total de electrones por serie de inclinación se limitó a 100 e/Å2. En total, se recogieron 167 series de inclinación de la lámina molida con crio-FIB de parásitos nativos, pero solo alrededor del 10% de ellas contenían el complejo apical completo o parcial. Se registraron 19 series de inclinación de la región apical de parásitos tratados con detergente (no molidos con crio-FIB).

Hay varios factores que contribuyen al bajo rendimiento del complejo apical en nuestros experimentos. En primer lugar, hemos congelado por inmersión los parásitos intactos en una capa de hielo relativamente gruesa (> 1 μm). Es un desafío determinar los extremos apicales y basales de las células incrustadas en hielo en el instrumento de fresado crio-FIB. En segundo lugar, durante el paso de molienda crio-FIB, el espesor del hielo se redujo de más de 1 μm a 150-200 nm, eliminando más del 80% del volumen. Por lo tanto, la probabilidad de colocar la lámina exactamente en la región del conoide de aproximadamente 300 nm de ancho es relativamente baja en comparación con el fresado accidental del complejo apical durante el paso de adelgazamiento. Finalmente, alrededor del 10-15% de las laminillas se dañaron o contaminaron en la superficie durante el paso de transferencia del instrumento de fresado al TEM. La aplicación futura de sistemas de molienda y autocargador crio-FIB guiados por fluorescencia para una transferencia más directa de muestras molidas con FIB al TEM podría abordar estos problemas y aumentar el rendimiento del experimento.

Se corrigió el movimiento de los fotogramas de cada imagen de la serie de inclinación utilizando MotionCor2 v1.2.3 y luego se fusionaron utilizando el script extraído del paquete de software IMOD v4.9.372 para generar el conjunto de datos de serie de inclinación final. Las imágenes de la serie Tilt se alinearon sin fiduciales utilizando el seguimiento de parches (tamaño de 800 × 800 píxeles) o utilizando características oscuras como fiduciales (p. ej., gránulos de la capa de pulverización catódica o galio incrustado del proceso de fresado) utilizando el paquete de software IMOD. Las reconstrucciones tomográficas se calcularon usando retroproyección ponderada antes del promedio de subtomogramas y una técnica de reconstrucción iterativa simultánea para visualizar datos de tomogramas sin procesar con mayor contraste, por ejemplo, para recoger partículas. De las 167 series de inclinación registradas de parásitos nativos molidos crio-FIB, 125 series de inclinación se reconstruyeron para una inspección adicional, y 20 de los tomogramas reconstruidos contenían el complejo apical (13 en estado protruido y siete en estado retraído). Los subtomogramas que contienen la fibra conoide, las repeticiones ICMT o PCR se extrajeron de los tomogramas sin procesar, se alinearon y se promediaron con compensación de cuña faltante utilizando el programa PEET v1.10.073,74. Aproximadamente 1160 y 721 repeticiones de fibra conoide de 8 nm se seleccionaron de los tomogramas de conoide nativos salientes y retraídos, respectivamente, y 386 repeticiones ICMT de 8 nm se seleccionaron de los tomogramas reconstruidos de muestras extraídas con detergente. Para el promedio de PCR, se seleccionaron 180 subtomogramas de cuatro tomogramas (tres conoides sobresalientes y uno retraído), y se generaron listas de motivos iniciales con orientaciones iniciales utilizando las funciones spikeInit en IMOD. Las correlaciones de la capa de Fourier se calcularon usando la función calcFSC y se trazaron usando la función plotFSC en IMOD. Para la punta del micronema, se extrajeron, alinearon y promediaron 25 subtomogramas de tres tomogramas (dos protruidos y uno retraído). Los parámetros relacionados con la recopilación y el procesamiento de datos se resumen en la Tabla complementaria 1. Para la visualización de cortes tomográficos sin procesar, se eliminó el ruido de los tomogramas para mejorar la claridad utilizando difusión anisotrópica no lineal o un filtro de mediana ponderada (filtro suave) implementado en IMOD. Las representaciones de isosuperficies y la segmentación celular con coloreado manual se generaron utilizando el paquete de software UCSF Chimera v1.10.275, que fue desarrollado por Resource for Biocomputing, Visualization and Informatics de la Universidad de California, San Francisco, con el apoyo de NIH P41-GM103311. La película fue renderizada en Chimera y comprimida con ffmpeg v5.1.1.

Los roptrios, los micronemas y las vesículas se pueden distinguir en función de sus morfologías distintivas. Las roptrias tienen una forma de maza única y podrían dividirse en dos regiones estructurales separadas: un cuello tubular anterior y un bulbo posterior ubicado más profundamente dentro del cuerpo celular. Los micronemas son orgánulos de tamaño mediano, similares a varillas, y su interior muestra una densidad de electrones más oscura que otros orgánulos. Las vesículas que están estrechamente asociadas con el ICMT o la membrana plasmática apical son pequeñas (diámetro <50 nm), redondas u ovaladas, y su contenido parece más brillante (es decir, propiedades de dispersión de electrones más bajas) que el citoplasma.

Para medir las dimensiones del conoide, los tomogramas se rotaron en las ventanas de corte de IMOD, con el plano inferior orientado horizontalmente. Luego se usó la distancia máxima en la sección longitudinal a través del centro del conoide para determinar las dimensiones del conoide, como se muestra en la Fig. 5a complementaria. Se midieron y compararon tres conoides protruidos y tres retraídos. Las longitudes de las fibras conoides se midieron de la siguiente manera: después de rastrear manualmente la fibra conoide usando el programa IMOD, la longitud de las fibras conoides y el espacio entre las fibras conoides adyacentes se determinaron usando los comandos IMOD imodinfo y mtk, respectivamente. En total, se midieron 20 fibras conoides de longitud completa de los conoides salientes y 12 de los conoides retraídos. Para comparar las APR y las PCR en parásitos con conoide protruido o retraído, medimos sus diámetros de la siguiente manera: los tomogramas se rotaron en la ventana de la cortadora IMOD hasta que se pudieron guardar las vistas transversales de las PCR y las APR (como se ve en la Fig. 5b, c); luego se determinaron los diámetros de los anillos utilizando las herramientas de círculo ImageJ (Fiji distribution v1.53c). Se realizaron mediciones de tres APR y tres PCR de conoides salientes, y tres APR y dos PCR de conoides retraídos. La distancia entre el conoide y el IMC se midió de la siguiente manera: colocamos el centro de la vista en la ventana de corte de IMOD en el extremo apical del IMC y luego rotamos el tomograma alrededor de este punto central en 3D para encontrar la distancia más corta entre el conoide y el extremo apical del IMC.

Hemos resumido la cantidad de tomogramas representativos para cada panel de figuras en la Tabla complementaria S2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas de densidad promedio de subtomograma de la fibra conoide de Neospora caninum en los estados protruidos y retraídos, y un promedio global que combina datos de ambos estados, se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con el código de acceso EMD-28247, EMD-28249, y EMD-26873, respectivamente. Los mapas de densidad promedio del subtomograma de las PCR P1-P2, P3 y el mapa compuesto de P1-P2-P3 se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con el código de acceso EMD-28231, EMD-28234 y EMD- 28246, respectivamente. Todos los demás datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o en los Materiales complementarios. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Daniel Stoddard por la capacitación y la gestión de la instalación de microscopía crioelectrónica en la Universidad de Texas, Southwestern Medical Center, que cuenta con el apoyo parcial del Premio CPRIT Core Facility Support Award RP170644. Esta investigación fue apoyada en parte por los recursos computacionales proporcionados por la instalación de supercomputación BioHPC ubicada en el Departamento de Bioinformática de Lyda Hill, UT Southwestern Medical Center.

kai cai

Dirección actual: Departamento de Biofísica, Universidad de Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, EE. UU.

Departamento de Biología Celular, Universidad de Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, EE. UU.

Long Gui, Kai Cai, Evan Reetz y Daniela Nicastro

Departamento de Farmacología, Universidad de Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, EE. UU.

William J. O'Shaughnessy y Michael L. Reese

Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, EE. UU.

Michael L.Reese

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MLR y DN concibieron el proyecto; LG realizó la reconstrucción del tomograma, el promedio de subtomogramas, el análisis de datos, la figura y la preparación de películas; WJO realizó cultivo celular, preparación de muestras y análisis de datos; KC realizó la preparación criogénica, la recopilación de datos crio-ET y el procesamiento de imágenes inicial; ER realizó molienda crio-FIB; MLR realizó el análisis de datos y escribió el manuscrito con la ayuda de LG y DN; DN realizó el análisis de datos y supervisó el proyecto general. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH; R01GM083122 a DN y R01AI150715 a MLR), el Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas (CPRIT; RR140082 a DN), la Fundación Nacional de Ciencias (MCB1553334 a MLR) y la Fundación Welch (I-2075-20210327 a MLR).

Correspondencia a Michael L. Reese o Daniela Nicastro.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Naomi Morrissette y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Gui, L., O'Shaughnessy, WJ, Cai, K. et al. La criotomografía revela el movimiento de cuerpo rígido y la organización de la maquinaria de invasión apicomplexa. Nat Comun 14, 1775 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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Recibido: 30 de septiembre de 2022

Aceptado: 10 de marzo de 2023

Publicado: 30 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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